【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种rna核酸适体单轮/寡轮筛选方法。
技术介绍
1、核酸适体(aptamer)是一种可以特异性地与靶标结合的单链核苷酸(dna或rna分子)，分子量小，易设计合成，可折叠形成特定构象特异性结合生物靶标，也因此被美誉为“化学抗体”。核酸适体具备合成简单、易修饰、化学性质稳定、免疫原性低、成本低廉等优点，可作为良好的发新型高效稳定的分子探针，在癌症的早期诊断和精准靶向治疗、药物治疗以及生物化学传感等领域极具前景。
2、靶标结合核酸适体的选择通常采用selex的方法，该方法允许我们从1013-1016个初始核酸分子中指数化富集结合的序列，并借由测序技术得到特定核酸适体的候选序列，然后通过表面等离子共振、等温量热滴定等技术手段测量候选适配体和靶标的结合。在过去的几十年里，为了得到性能更优良、更丰富的核酸适体，研究者在selex方法的改进上进行了大量的探索，提出了包括cell-selex、capture-selex、go-selex、gold-selex等selex新方法，这些方法客观上提高了筛选的效率，但重复选择结合pcr扩增的固有属性使得我们仍然面临着不可避免的伪影带来的指数富集相关的不确定性。这些伪影产生的原因很复杂，包括非核酸适体的不彻底分离、引物序列的影响以及pcr扩增、转录和逆转录过程中的序列偏好。
3、除了对selex方法的优化外，研究者们试图通过缩短选择的时间、简化适体选择的步骤的方式来规避selex过程的不利影响，即通过单轮选择的方式分离适配体，这些方法大多用于dna
4、然而，rna适体的选择与dna适体的选择有着显著的区别，这体现在rna的不稳定性和不能直接作为pcr的模板进行扩增，这意味着在rna适体的选择中对筛选轮数的缩减可能是更有意义的。同时，基于rna核酸适体本身可以通过体内或体外转录大量制备的特点，基于rna的体内调控或体外规模化生产具有独特的价值，提高rna核酸适体的获取效率具有重要意义。现有的关于rna适体的单轮筛选方法的报道是鲜见的，这包括了使用人类基因组rna库作为初始文库的ht-seq研究和基于rnase消化和已知序列dna载体的rna适体单轮选择方法。然而，这些方法都存在着各自的局限性，目前我们仍然缺乏性能良好的rna适体，开发rna适体单轮筛选方法仍然是一项有意义的工作。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种rna核酸适体单轮/寡轮筛选方法。
2、第一方面，本专利技术要求保护一种rna核酸适体单轮/寡轮筛选方法。
3、本专利技术所要求保护的rna核酸适体单轮或寡轮筛选方法，可包括如下步骤：
4、(a1)借鉴传统的cell-selex技术进行rna核酸适体单轮或寡轮筛选(不执行反筛过程)，得到靶向靶细胞的筛选产物文库；
5、(a2)将所述筛选产物文库逆转录为cdna，在进行所述逆转录的过程中引入umi识别符，然后对产物进行高通量测序，从测序结果中获得rna核酸适体序列。
6、进一步地，所述步骤(a2)可按照如下进行：将所述筛选产物文库与所述靶细胞进行孵育后，利用流式细胞分选技术分选出活细胞，并使用umi文库作为引物进行逆转录，得到的cdna经pcr扩增后进行高通量测序；所述umi文库的序列为：5′-tggtgcgaattctgagaggt–nm-xxxx-tcgggcgagtcgtctg-3′；其中，nm(即前文所述umi识别符)表示m个连续的n，用于区分同一个umi文库的不同序列；xxxx为barcode序列，用于区分不同的umi文库；n和x均表示a或t或c或g；m为10-50的正整数；所述umi文库中每种序列仅含有一个拷贝。
7、在本专利技术的具体实施方式中，xxxx具体为aggt，根据需求可以替换为其余碱基。
8、在本专利技术的具体实施方式中，m为30。
9、进一步地，在步骤(a1)中，进行所述rna核酸适体单轮或寡轮筛选过程中，采用的随机核酸文库(libdd dna)序列如seq id no.12所示(n40表示30个连续的n，n表示a或t或c或g)。
10、进一步地，在步骤(a1)中，进行所述rna核酸适体单轮或寡轮筛选过程中，采用由libdd上游引物和libdd下游引物组成的引物对所述随机核酸文库中能够与所述靶细胞结合的序列进行pcr扩增；所述libdd上游引物的序列如seq id no.13所示；所述libdd下游引物的序列如seq id no.14所示。
11、更进一步地，在步骤(a2)中，进行所述pcr扩增时采用的引物为所述libdd上游引物(seq id no.13)和umi文库上游引物；所述umi文库上游引物的序列如seq id no.16所示。
12、在本专利技术的具体实施方式中，所述靶细胞为人结直肠癌细胞株hct-8或小鼠成肌细胞株c2c12。相应地，利用所述方法获得的能够识别并结合c2c12细胞的rna核酸适体如seq id no.6-11所示，能够识别并结合hct-8细胞的rna核酸适体如seq id no.1-5所示。
13、在上述方法中，所述寡轮指为一轮以上十轮以下，如两轮。相应的，在第二轮筛选过程中可适当增加筛选压力：包括减少靶细胞数量，减少细胞孵育时间，增加洗涤次数。
14、在本专利技术的具体实施方式中，所述靶细胞为人结直肠癌细胞株hct-8或小鼠成肌细胞株c2c12。
15、第二方面，本专利技术要求保护一种成套单链dna。
16、本专利技术要求保护的成套单链dna，可包括：
17、(b1)随机核酸文库(libdd dna)，序列如seq id no.12所示；
18、(b2)libdd上游引物，序列如seq id no.13所示；
19、(b3)libdd下游引物，序列如seq id no.14所示；
20、(b4)umi文库，序列如seq id no.15所示；
21、(b5)umi文库上游引物，序列如seq id no.16所示。
22、第三方面，本专利技术要求保护前文第二方面中所述的成套单链dna在通过前文第一方面中所述方法筛选rna核酸适体中的应用。
23、第四方面，本专利技术要本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RNA核酸适体单轮或寡轮筛选方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(A2)按照如下进行：将所述筛选产物文库与所述靶细胞进行孵育后，利用流式细胞分选技术分选出活细胞，并使用UMI文库作为引物进行逆转录，得到的cDNA经PCR扩增后进行高通量测序；所述UMI文库的序列为：5′-TGGTGCGAATTCTGAGAGGT–NM-XXXX-TCGGGCGAGTCGTC TG-3′；其中，NM表示M个连续的N，用于区分同一个UMI文库的不同序列；XXXX为barcode序列，用于区分不同的UMI文库；N和X均表示A或T或C或G；M为10-50的正整数；所述UMI文库中每种序列仅含有一个拷贝。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤(A1)中，进行所述RNA核酸适体单轮或寡轮筛选过程中，采用的随机核酸文库序列如SEQ ID No.12所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(A1)中，进行所述RNA核酸适体单轮或寡轮筛选过程中，采用由LibDD上游引物和LibDD下游引物组成的
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(A2)中，进行所述PCR扩增时采用的引物为所述LibDD上游引物和UMI文库上游引物；所述UMI文库上游引物的序列如SEQ ID No.16所示。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述靶细胞为人结直肠癌细胞株HCT-8或小鼠成肌细胞株C2C12。
7.成套单链DNA，包括：
8.权利要求7所述的成套单链DNA在通过权利要求1-6中任一所述方法筛选RNA核酸适体中的应用。
9.利用权利要求1-6中任一所述方法筛选得到的RNA核酸适体在对正常细胞和不同来源肿瘤细胞进行分子分型中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述正常细胞选自如下：HEK-293T、SV-HUC-1、C2C12、DC2.4；和/或
...【技术特征摘要】
1.一种rna核酸适体单轮或寡轮筛选方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a2)按照如下进行：将所述筛选产物文库与所述靶细胞进行孵育后，利用流式细胞分选技术分选出活细胞，并使用umi文库作为引物进行逆转录，得到的cdna经pcr扩增后进行高通量测序；所述umi文库的序列为：5′-tggtgcgaattctgagaggt–nm-xxxx-tcgggcgagtcgtc tg-3′；其中，nm表示m个连续的n，用于区分同一个umi文库的不同序列；xxxx为barcode序列，用于区分不同的umi文库；n和x均表示a或t或c或g；m为10-50的正整数；所述umi文库中每种序列仅含有一个拷贝。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤(a1)中，进行所述rna核酸适体单轮或寡轮筛选过程中，采用的随机核酸文库序列如seq id no.12所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(a1)中，进行所述rna核酸适体单轮或寡轮筛选过程中，采用由libdd上游引物和libd...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭蔚泓，邴涛，武晓秋，张登伟，刘雨晴，谢斯滔，
申请(专利权)人：中国科学院杭州医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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