【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检测，具体涉及crispr光电流极性翻转生物传感器及其在联合检测lncrnas中的应用。
技术介绍
1、长链非编码rna(long non-coding rnas，lncrnas)是一种长度超过200nt的非编码rna。在过去的很长一段时间里，lncrnas被认为是基因组中没有生物学功能的"暗物质"。然而，近年来大量研究已经证实lncrnas表达或功能异常与癌症的发生发展密切相关，尤其在癌细胞凋亡调控、肿瘤浸润与转移等过程中发挥着促癌作用，故lncrna有望成为癌症早期诊断的新型分子标记物。如同源异形盒转录反义rna(hotair)是第一个发现具有反式调控作用的lncrna，其表达上调与卵巢癌、宫颈癌、肺癌等恶性肿瘤的发生密切相关。哺乳动物转移相关肺腺癌转录本1(malat1)首先在非小细胞肺癌患者中被发现，并且其表达上调与细胞增殖增加、凋亡、dna修复机制缺陷、肿瘤促进炎症等有关。但是单一检测某种lncrna来诊断癌症存在不足，因此，联合检测多种lncrna来提高诊断的准确率。因此，发展lncrna的分析与检测方法对于推动癌症的早期诊断具有重要作用。常见的lncrna检测方法包括定量逆转录聚合酶链式反应(rt-qpcr)、微阵列、rna测序和数字pcr等，但它们通常存在过程耗时、样本消耗大、灵敏度不足、仪器昂贵和数据分析复杂等问题。光电化学(pec)生物传感器具有灵敏度高、成本低、操作简单等优点，因此在dna检测、免疫分析等方面得到广泛应用。然而，目前关于pec生物传感器检测lncrna的报道还很少，而且该p
2、近年来，基于rna引导的crispr/cas核酸酶的检测方法由于其优良的靶向性能而被发展成为核酸诊断技术的流行方法。crispr/cas13a系统已经证实具有crrna引导的特定靶rna识别能力，随后激活cas13a的核糖核酸酶(rnase)活性，非特异性地切割合理设计的单链rna(ssrna)，实现信号放大。除此之外，为了提高检测灵敏度，dnazyme的信号放大技术近年来得到了广泛的关注，其利用金属离子作为辅助因子来裂解特定的底物，从而激活裂解反应。由于dnazyme良好的稳定性、高的催化效率和易于功能化，可以选择理想的生物催化放大器，以实现信号显著增强。
技术实现思路
1、本专利技术通过crispr/cas13a系统和双方向dnazyme步行器双重信号放大技术，以n-cu-mofs衍生的氮掺杂碳-铜/氧化亚铜(nc-cu/cu2o)为信号源，crrna作为捕获目标物的捕获探针，构建了光电流极性翻转生物传感器，并用于lncrna的检测。本专利技术的生物传感器可以只通过改变crrna捕获探针序列来检测不同lncrnas，而无需改变其他核酸序列，显示出在多识别的生物分析研究中的应用前景。并且通过对大量人群样本进行检测，可以区分肺癌患者和健康人群，为生物医学研究和早期临床诊断提供了一种通用的范例。
2、本专利技术具体采用以下技术方案：
3、本专利技术首先提供一种crispr光电流极性翻转生物传感器，该传感器用于检测目标lncrna，包括：
4、(1)表面固定有硫化镉量子点的电极，所述硫化镉量子点表面修饰有标记巯基的单链dna s3；所述单链dna s3在使用前进行了去二硫化。
5、进一步的，所述电极具体为ito电极；硫化镉量子点还用6-巯基-1-己醇(mch)封闭活性位点。
6、(2)氨基化的壳层二氧化硅磁珠、标记有生物素和羧基的发夹探针hp2、crrna、cas13a、带有rna序列的发夹hp1、辅助因子mg2+，其中，目标lncrna序列与crrna的部分序列互补配对；
7、氨基化的壳层二氧化硅磁珠可与标记有生物素和羧基的发夹探针hp2反应得到壳层二氧化硅磁珠-hp2复合物；当目标物lncrna存在时，可以激活crispr/cas13a；然后带有rna序列的发夹hp1可被crispr/cas13a非特异性切割，产生两条dnazyme步行足s1和s1’，步行足s1和s1’在辅助因子mg2+辅助下形成双向dnazyme步行器，可切割发夹探针hp2产生单链dna s2。其中氨基化的壳层二氧化硅磁珠具体可为氨基化的fe3o4@sio2 nps，发夹hp1中的rna序列具体可为uuuuu序列；单链dna s2与单链dna s3的碱基互补配对。
8、目标物lncrna具体可为lncrna hotair和lncrna malat1，本专利技术生物传感器除了适用于检测这两个lncrna外，还可以用于检测其他lncrna。
9、(3)链霉亲和素修饰的nc-cu/cu2o。
10、氨基功能化的链霉亲和素的nc-cu/cu2o采用以下方案制备：
11、①在cu(no3)2的二甲基甲酰胺溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮，然后加入1,3,5-苯三甲酸的二甲基甲酰胺溶液。将混合物在80℃下反应24h，离心收集固体，洗涤，在60℃下干燥过夜，得到n-cu-mof，将干燥后的固体研磨后在350℃、氮气氛围下保持2h，得到nc-cu/cu2o八面体。
12、②将nc-cu/cu2o八面体分散在乙醇/水溶液中(2ml，v/v，19/1)，然后，在nc-cu/cu2o悬浮液中加入氨丙基三乙氧基硅烷，超声处理。之后，在75℃下震荡加热1小时。然后将悬浮液用无水乙醇离心洗涤，在60℃干燥过夜，最后得到氨基功能化的sa-nc-cu/cu2o八面体。
13、本专利技术又公开了crispr光电流极性翻转生物传感器在联合检测lncrnas中的应用，所述应用不以疾病诊断和治疗为目的；具体如下：
14、(1)取crrna、cas13a、发夹hp1、壳层二氧化硅磁珠-hp2、dnazyme辅助因子mg2+、核糖核酸酶抑制剂、cas酶缓冲液和目标lncrnas，充分混匀后，置于37℃反应120min，然后进行磁分离，取上清。
15、(2)取cds qds于清洗后的电极上，室温干燥。
16、(3)然后将去二硫化的单链dnas3涂在(2)得到的电极表面，在4℃下保存过夜。
17、(4)将mch溶液滴在(3)得到的电极表面，以阻断非特异性位点。
18、(5)然后将(1)中所得上清加入到(4)得到的电极上，在37℃下处理1h。
19、(6)将(5)制备的电极与链霉亲和素修饰的nc-cu/cu2o悬浮液在37℃下孵育，记录光电流信号。
20、单链dna s3的序列为ggtccaccaccagactccctttttttt-sh，
21、发夹hp1的序列为
22、cct本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.CRISPR光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，所述传感器用于检测目标lncRNA，该传感器包括：
2.根据权利要求1所述的CRISPR光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(1)中所述电极为ITO电极。
3.根据权利要求1所述的CRISPR光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(1)中硫化镉量子点还用6-巯基-1-己醇封闭活性位点。
4.根据权利要求1所述的CRISPR光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(2)中氨基化的壳层二氧化硅磁珠与标记有生物素和羧基的发夹探针HP2反应得到壳层二氧化硅磁珠-HP2复合物。
5.根据权利要求1所述的CRISPR光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(2)中氨基化的壳层二氧化硅磁珠为氨基化的Fe3O4@SiO2 NPs。
6.根据权利要求1所述的CRISPR光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(2)中发夹HP1中的RNA序列具体为UUUUU。
7.根据权利要求1所述的CRISPR光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(3)中链霉亲和素修饰的氮掺杂碳-铜/氧化亚铜
8.权利要求1～7任一项所述的CRISPR光电流极性翻转生物传感器在联合检测lncRNAs中的应用，其特征在于，所述应用不以疾病诊断和治疗为目的；具体如下：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.crispr光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，所述传感器用于检测目标lncrna，该传感器包括：
2.根据权利要求1所述的crispr光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(1)中所述电极为ito电极。
3.根据权利要求1所述的crispr光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(1)中硫化镉量子点还用6-巯基-1-己醇封闭活性位点。
4.根据权利要求1所述的crispr光电流极性翻转生物传感器，其特征在于，(2)中氨基化的壳层二氧化硅磁珠与标记有生物素和羧基的发夹探针hp2反应得到壳层二氧化硅磁珠-hp2复合物。
5.根据权利要求1所述的crispr光电流极性翻转生物传感器，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨瑞英，李玉玲，季江颖，丁丽华，原鑫鑫，严志怡，薛林生，吴拥军，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。