【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体涉及检测呼吸道病毒的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
1、呼吸道感染(rti)是最常见的疾病之一，青少年和成人每年大约被感染2-4次，儿童每年大约被感染6-8次。儿童下呼吸道感染病原体中病毒占比高达61.4％，成人社区获得性肺炎中病毒也占有较高比例(15-34.9％)。除了极高的感染频率，部分严重的急性呼吸道病毒感染可以造成严重的后果。据世界卫生组织统计，每年因呼吸道病毒感染造成的社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，cap)达2亿人次，其中1.5亿儿童患者为发展中国家的儿童，其中重症病例＞1460万例，死亡儿童＞100万例。同时，呼吸道病毒感染也可以导致多种并发症，包括中耳炎、鼻窦炎和继发细菌感染等。尤其重要的是，呼吸道病毒感染是儿童哮喘急性发作最为重要的诱因之一：呼吸道病毒感染占3岁以下儿童喘息发作诱因的90％以上；即使在学龄儿童，呼吸道感染也占其哮喘急性发作诱因的80％～85％。因此进行呼吸道病原体检测具有重要的临床意义。常见的呼吸道感染病毒主要有甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、副流感病毒等。
2、呼吸道病毒的主要检测方式是血清学检查、病毒的分离和培养、抗原及抗体检查、pcr检测。病毒的分离和培养是证明呼吸道病毒感染的“金标准”，特异性高，但耗时长，操作复杂，对技术和环境要求高；抗原检测也是病毒感染早期诊断的主要方式之一，但其灵敏度低，容易出现假阴性结果；病毒抗体检测：机体感染病毒后，早期出现igm抗体，随后ig
3、随着检测行业发展的需求和人们对精准医疗的重视，多基因、多病原体的联合检测变得越来越迫切，同时第二代测序(ngs)等具有更高检测通量的新技术的兴起也对多重pcr技术提出了更高的要求。与多重pcr相比ngs技术具有高通量的技术优势，但其仪器试剂成本更高、检测周期长、操作复杂。若能提高多重pcr的检测通量能大大提高多重pcr技术的应用。因此需要设计一种可提高荧光pcr仪单管检测通量的试剂盒及其使用方法。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供检测呼吸道病毒的试剂盒及其使用方法，基于探针法和熔解法分别进行检测，提高检测通道数和呼吸道病毒的检测效率。
2、本专利技术公开了基于探针法和熔解法检测呼吸道病毒的试剂盒,包括反应液，所述反应液含有：甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的扩增引物和荧光探针，以及副流感病毒i型和副流感病毒iii型的引物；副流感病毒i型的引物为：fam-taaggataagtcacagacattt(bhq1)gat和attgatgctcttctcct；副流感病毒iii型的引物为：fam-ttggaccgacaataactgat(bhq1)gac和aaagacaccaagaaccctgcc，fam为荧光基团、bhq1为淬灭基团。
3、优选的，所述反应液还含有内标的引物，所述内标的引物为：fam-agcatcctgctggtggtt(bhq1)ac和caaagagtcctggcccacat。
4、优选的，所述甲型流感病毒的扩增引物为：tcacagcagacagggggata和acggctaggggtgataccat，探针为：fam-atgattcctgaaaggaatga-bhq1；
5、乙型流感病毒的扩增引物为：gttggctaaaattgaa和ttcttttcaattcttgat，探针为：vic-taaagcagctgttaagggac-bhq1；
6、合胞病毒的扩增引物为：aactcctttggttagagatg和ttcatcattgtcaaacagatt，探针为：cy5-agcaactcattgagtatgat-bhq3；
7、腺病毒的扩增引物为：atcgtgtggtgattggctgt和tccacccccacaaaacgtc，探针为：rox-ccaattgccgattttcc-bhq2；
8、其中，vic、cy5和rox分别为荧光基团，bhq2和bhq3分别为淬灭基团。
9、优选的，所述试剂盒还包括酶液和pcr缓冲液，所述酶液含有逆转录酶、taq dna聚合酶和udg酶；所述反应液含有：引物探针、氯化镁以及dntp/dutp。
10、本专利技术还提供一种利用上述试剂盒检测呼吸道病毒的使用方法，包括以下步骤：提取待测样本的核酸；利用试剂盒配制pcr反应液；利用所述核酸和pcr反应液进行扩增；获得扩增产物的多个通道荧光强度和熔解曲线；根据所述多个通道荧光强度，获得甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的检测结果；根据熔解曲线的检出峰获得副流感病毒i型和副流感病毒iii型的检测结果。
11、优选的，在变性阶段采集所述通道荧光强度。
12、优选的，所述通道荧光强度的采集温度温92-96度。
13、优选的，所述副流感病毒i型的检出峰为80±1℃，所述副流感病毒iii型的检出峰为85±1℃。
14、优选的，根据熔解曲线获得内标的检出峰，所述内标的检出峰为71±1℃。
15、优选的，采用约登指数判断甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的检测结果。
16、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：在荧光探针的扩增检测的基础上，引入熔解曲线对样本进行检测，提高了多重pcr的检测通量，提高呼吸道病毒的检测效率。
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1.一种检测呼吸道病毒的试剂盒,其特征在于，包括反应液，所述反应液含有：甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒、腺病毒的扩增引物和探针，以及副流感病毒I型和副流感病毒III型的引物；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液还含有内标的引物，所述内标的引物为：FAM-AGCATCCTGCTGGTGGTT(BHQ1)AC和CAAAGAGTCCTGGCCCACAT。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述甲型流感病毒的扩增引物为：TCACAGCAGACAGGGGGATA和ACGGCTAGGGGTGATACCAT，探针为：FAM-ATGATTCCTGAAAGGAATGA-BHQ1；
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶液和PCR缓冲液，所述酶液含有逆转录酶、Taq DNA聚合酶和UDG酶；
5.如权利要求1-4任一项所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，在变性阶段采集所述通道荧光强度。
7.根据权利要求6所述的使用方法，
8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述副流感病毒I型的检出峰为80±1℃，所述副流感病毒III型的检出峰为85±1℃。
9.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，还根据熔解曲线获得内标的检出峰，所述内标的检出峰为71±1℃。
10.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，采用约登指数判断甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的检测结果。
...【技术特征摘要】
1.一种检测呼吸道病毒的试剂盒,其特征在于，包括反应液，所述反应液含有：甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒、腺病毒的扩增引物和探针，以及副流感病毒i型和副流感病毒iii型的引物；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液还含有内标的引物，所述内标的引物为：fam-agcatcctgctggtggtt(bhq1)ac和caaagagtcctggcccacat。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述甲型流感病毒的扩增引物为：tcacagcagacagggggata和acggctaggggtgataccat，探针为：fam-atgattcctgaaaggaatga-bhq1；
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶液和pcr缓冲液，所述酶液含有...
【专利技术属性】
技术研发人员：岑双双，柳辉，毕德熙，沈亚南，郑文果，毕少辉，
申请(专利权)人：北京康美天鸿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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