基于高分辨率熔解曲线检测septin9基因甲基化的特异引物对和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于高分辨率熔解曲线检测septin9基因甲基化的特异引物对和试剂盒。本发明专利技术首先保护一种特异引物对，由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成。本发明专利技术还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用。所述试剂盒的功能为诊断或辅助诊断结直肠癌、检测septin9基因启动子区甲基化、检测septin9基因启动子区CpG岛甲基化。采用本发明专利技术提供的引物对通过甲基化特异性PCR结合HRM曲线分析检测septin9基因甲基化，具有操作简便、特异性好、灵敏度高、成本低廉的优点。本发明专利技术可用于结直肠癌患者的早筛或辅助诊断，在健康筛查和临床辅助诊断中具有很好的前景。

【技术实现步骤摘要】
基于高分辨率熔解曲线检测septin9基因甲基化的特异引物对和试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种基于高分辨率熔解曲线检测septin9基因甲基化的特异引物对和试剂盒。
技术介绍
结直肠癌是常见消化道恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食道癌。在我国恶性肿瘤的病死率中，结直肠癌患者在男性中占第5位，女性中占第6位。近20年来结直肠癌的发病率在逐渐增加，在我国超过80％患者确诊时已发展到中晚期，早期诊断率仅为10％-15％，国内调查显示，早期术后存活率达90％-95％，而晚期则只有5％。手术治疗可使早期结直肠癌得到根治，而晚期结直肠癌经化学放疗联合分子靶向治疗后平均生存时间仍不足30个月，因此，结直肠癌早期诊断显得非常重要和迫切。DNA甲基化状态改变与结直肠癌的发生发展关系密切。结直肠癌患者中septin9基因CpG岛高度甲基化。因此，septin9基因CpG岛甲基化可作为结直肠癌潜在的诊断标志物。Septin9基因在结直肠癌发生中起抑癌基因作用，甲基化会抑制该基因正常表达，使其抑癌功能丧失，并最终导致细胞分裂和癌变。研究发现Septin9基因在结直肠癌患者的肿瘤组织和外周血中均高表达，而在健康人群或其他疾病患者中均低表达，且灵敏度和特异度最高，由此建立了血浆中Septin9基因表达量是结直肠癌最佳候选标志物的基础理念；随后，又通过实验分析结直肠癌患者和健康对照者血浆样本中Septin9基因表达情况发现，在结直肠癌组织中Septin9基因存在高度的甲基化。在结直肠癌患者中Septin9基因CpG岛发生甲基化，正常人Septin9基因CpG岛不发生甲基化。基因甲基化检测技术大致可以分为两类，特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析。甲基化特异性PCR(MS-PCR)，具有灵敏度高、不受内切酶的限制、无需特殊仪器、经济实用的优点，并且可用于石蜡包埋样本。对于甲基化特异性PCR来说，最重要的是设计出质量好的引物。亚硫酸氢盐处理结合测序方法，是DNA甲基化分析的金标准，可靠且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐。荧光定量方法(Methylight)优势在于高通量和高灵敏度，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少污染和操作误差。高分辨率熔解曲线分析(High-resolutionmelting，HRM)是一种新的分子检测技术，广泛应用于基因突变、基因甲基化水平检测及基因分型检测和HLA配型等领域，具有低成本、高通量、无污染、快捷、操作简便、敏感性和特异性好的特点，灵敏度大于1-5％，且不需要对PCR产物进行后续操作。高分辨率熔解技术与普通熔解曲线原理是一致的，都是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况；二者不同之处主要表现在升温速率和所用的染料。它使用的是一种新型饱和染料(如EVAGreen)，解链时染料脱落，荧光信号降低，通过检测荧光信号随温度的变化即可得到扩增产物的熔解曲线。传统熔解曲线技术应用的染料在高浓度时会抑制PCR，故难以达到足够的浓度与PCR产物饱和结合，而HRM应用的饱和染料在相当大的浓度范围内均不影响PCR扩增，故能与PCR产物饱和结合而更准确的反映DNA解链过程。这种染料具有更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，同时结合带有高分辨率熔解分析功能的实时荧光定量PCR仪(如Rotor-GeneQ)精确的温度控制能力。此外，HRM熔解仪与常规熔解仪相比，具有更高的数据采集速率、荧光信号敏感度和温度精确度，并确保样品间温度的一致，从而大大提高了数据的精确性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于高分辨率熔解曲线检测septin9基因甲基化的特异引物对和试剂盒。本专利技术首先保护一种特异引物对，由SEQIDNO：1所示的单链DNA分子和SEQIDNO：2所示的单链DNA分子组成。所述特异引物对的功能为诊断或辅助诊断结直肠癌。所述特异引物对的功能为检测septin9基因启动子区甲基化。所述特异引物对的功能为检测septin9基因启动子区CpG岛甲基化。本专利技术还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为诊断或辅助诊断结直肠癌。本专利技术还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测septin9基因启动子区甲基化。本专利技术还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测septin9基因启动子区CpG岛甲基化。本专利技术还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对；所述试剂盒的功能为诊断或辅助诊断结直肠癌。本专利技术还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对；所述试剂盒的功能为检测septin9基因启动子区甲基化。本专利技术还保护一种试剂或试剂盒，包括所述特异引物对；所述试剂盒的功能为检测septin9基因启动子区CpG岛甲基化。以上任一所述试剂盒还包括PCR扩增试剂和荧光染料。所述荧光染料具体可为饱和染料EVAGreen。所述PCR扩增试剂具体包括：TaKaRaExTaq、10×ExTaqBuffer(Mg2+free)、MgCl2、dNTPMixture。以上任一所述试剂盒还包括对DNA进行亚硫酸氢盐处理的试剂。以上任一所述试剂盒还包括记载有如下检测方法的载体：(1)提取待测样本的总DNA，然后进行亚硫酸氢盐处理；(2)进行PCR扩增以及高分辨率熔解曲线分析。PCR扩增的反应程序具体见表2。高分辨率熔解曲线分析的参数设置具体可为：65℃1s，然后按0.02℃/s的速度从65℃升至95℃(每秒收集25次荧光)，最后40℃30s。以上任一所述试剂盒还包括记载有如下判断标准的载体：在87℃±0.5℃位置出现熔解峰说明样本存在septin9基因甲基化(为候选的结直肠癌患者)，未在87℃±0.5℃位置出现熔解峰说明样本不存在septin9基因甲基化(为候选的非结直肠癌患者)。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物进行独立包装的步骤。以上任一所述septin9基因为编码人septin9蛋白的基因。人septin9蛋白具体如序列表的序列4所示。人cDNA中，septin9基因的开放阅读框具体如序列表的序列3中第309-2048位所示。septin9基因启动子区CpG岛具体可为序列表的序列3中第34-204位核苷酸。为了解决现有甲基化检测方法中操作繁琐、存在污染风险、灵敏度低和特异性不好的缺点，本专利技术提供了一对用于检测septin9甲基化的特异性引物，在septn9基因检测引物中加入了CG位点，选择性的使引物与甲基化序列互补结合，弥补对非甲基化序列倾向性导致的PCR偏倚，有效的增加septin9基因检测的灵敏度，可比甲基化荧光定量PCR具有更好的灵敏度。采用本专利技术提供的引物对通过甲基化特异性PCR结合HRM曲线分析检测septin9基因甲基化，具有操作简便、特异性好、灵敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异引物对，由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成。/n

【技术特征摘要】
1.特异引物对，由SEQIDNO：1所示的单链DNA分子和SEQIDNO：2所示的单链DNA分子组成。


2.如权利要求1所述的特异引物对，其特征在于：所述特异引物对的功能为诊断或辅助诊断结直肠癌。


3.如权利要求1所述的特异引物对，其特征在于：所述特异引物对的功能为检测septin9基因启动子区甲基化。


4.权利要求1所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为诊断或辅助诊断结直肠癌。


5.权利要求1所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测septin9基因启动子区甲基...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳辉，
申请(专利权)人：北京康美天鸿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11