【技术实现步骤摘要】
本专利技术的领域是工程化细胞，其使用细胞毒性的活化自然杀伤细胞系(nk-92)作为基础，以改善针对癌症和肿瘤的免疫疗法。
技术介绍
1、背景描述包括可用于理解本专利技术的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的专利技术相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
2、本文中的所有出版物和专利申请都通过援引并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过援引并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。
3、基于过继转移的肿瘤特异性细胞毒性淋巴细胞的癌症免疫疗法有望用于治疗恶性肿瘤患者。尽管这在某些癌症中取得了早期成功，但是肿瘤的治疗仍然是一项挑战，这主要是由于肿瘤微环境的免疫抑制性质。参见swarts等人“tumor microenvironmentcomplexity:emerging roles in cancer therapy[肿瘤微环境的复杂性：在癌症治疗中的新兴作用],”cancer res[癌症研究],第72卷,第2473-2480页,2012。除了经修饰的t细胞以外，正在探索基于nk细胞的免疫疗法。自然杀伤(nk)细胞是构成先天免疫系统的主要组成部分的细胞毒性淋巴细胞。通常占循环淋巴细胞的约10％-15％的自然杀伤(nk)细胞结合并杀伤对抗原不具有特异性并且没有既往免疫致敏的靶细胞(包括被病毒感染的细胞和许多恶性细胞)。herberman
4、淋巴结转移的常见驱动因素是缺氧驱动的ccr7上调，ccr7是一种主要在原初t细胞和树突状细胞中发现的趋化因子受体。先前已证明血液nk细胞上ccr7受体的上调会改善nk细胞向淋巴结的归巢，使它们遵循相同路径到达淋巴结隔室，这是转移性扩散的常见途径，但尚未在临床上相关的细胞系中得到证实。
5、因此，仍然需要改进nk细胞和基于nk细胞的疗法，特别是在nk细胞归巢至肿瘤微环境和调节肿瘤微环境的情况下。
技术实现思路
1、本文提供了经修饰的细胞，这些细胞包含编码多种功能元件的核酸。功能元件典型地是蛋白质或多肽，其提供改善细胞作为用于免疫疗法的细胞系的有效性的特定功能。一方面，细胞包含编码四个功能元件的核酸构建体。在一些实施例中，该核酸构建体包含与启动子可操作地连接的编码四个功能元件的序列(称为“四顺反子构建体”)。
2、在一些实施例中，由核酸构建体编码的第一元件是细胞因子，其提供对表达该细胞因子诸如il-2或il-15的细胞的选择。因此，在一些实施例中，该核酸编码细胞因子，诸如il-2或il-15。在一个实施例中，il-2在具有将il-2引导至内质网il-2(“eril-2”)的信号序列的情况下表达。在另一个实施例中，il-15在具有将il-15引导至内质网il-15(“eril-15”)的信号序列的情况下表达。
3、在一些实施例中，由核酸构建体编码的第二元件是fc受体。在一些实施例中，fc受体是fc-γ受体(fcγr)。在一些实施例中，fc-γ受体是fcγriii-a(也称为cd16)，其是与igg抗体结合并激活adcc的低亲和力fc受体。在一些实施例中，cd16受体在成熟形式的多肽的氨基酸位置158(f158v)(对应于包含信号序列的全长形式的多肽的位置176)处包含苯丙氨酸(f)-缬氨酸(v)取代(seq id no:12)。在一个实施例中，fc受体包含seq id no:13的核酸序列或seq id no:12的氨基酸序列。
4、在一些实施例中，第一元件和第二元件存在于该核酸构建体中。因此，在一些实施例中，该核酸构建体编码fc受体(诸如cd16)和eril-2。
5、在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是归巢受体。在一些实施例中，归巢受体是细胞因子受体、g蛋白偶联受体、趋化因子受体、细胞粘附分子、选择素或整合素。在一些实施例中，归巢受体与允许核酸转录的启动子可操作地连接。经修饰的细胞能够向趋化因子的来源迁移，趋化因子是受体的配体。与正常的血液来源的nk细胞不同，经修饰的细胞可以发育成与人类临床试验相关的细胞系，从而为免疫疗法提供明显的优势。归巢受体的实例包括g蛋白偶联受体，诸如趋化因子受体，包括但不限于ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、cxcr7、cx3cr1、xcr1、ccxckr、d6、darc或cxcl14受体；细胞因子受体；细胞粘附分子，诸如选择素，包括l-选择素(cd62l)；整合素，诸如α4β7整合素、lpam-1和lfa-1。在一些实施例中，归巢受体是细胞粘附分子，诸如lfa-1。在一些实施例中，归巢受体是选择素，诸如l-选择素(cd62l)。在一些实施例中，归巢受体是整合素，诸如α4β7整合素、lpam-1或vla-4。在一些实施例中，归巢受体是c-c或c-x-c趋化因子受体。因此，在一些实施例中，由该核酸编码的第三元件是本文所述的归巢受体。
6、在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是分泌型细胞因子，由此细胞因子增强或改善细胞作为免疫治疗剂的功能。该细胞因子还可以调节肿瘤微环境。在一些实施例中，调节肿瘤微环境的分泌型细胞因子是il-12或ifn-α。因此，在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是细胞因子，诸如il-12或ifn-α。
7、因此，在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是趋化因子，诸如xcl1、ccl5、ccl21或ccl16。在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是toll样受体(tlr)激动剂。
8、一方面，由核酸构建体编码的第三元件是il-12。
9、已知肿瘤内的tgf-β表达会抑制肿瘤微环境中白细胞的抗肿瘤活性。因此，在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是tgf-β抑制剂，例如抑制tgf-β的肽。在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是tgf-β阱。在一些实施例中，tgf-β阱包含tgfβrii分子的细胞外结构域。在一些实施例中，tgf-β阱包含tgfβrii分子的细胞外结构域的单链二聚体，并且最优选地包含tgf-β受体ii胞外域的单链二聚体。
10、在一些实施例中，本文所述的nk细胞与tgf-β抑制剂一起施用以阻断tgf-β并帮助去除免疫抑制。在一些实施例中，本文所述的nk细胞与其他免疫疗法一起施用以帮助减小或消除肿瘤。例如，可以通过肿瘤内注射抑制肽并结合肿瘤内注射聚(i本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种经修饰的NK-92细胞，该经修饰的NK-92细胞包含与启动子可操作地连接的编码转化生长因子(TGF)-β阱和嵌合抗原受体(CAR)的核酸，该嵌合抗原受体特异性结合程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)。
2.如权利要求1所述的经修饰的NK-92细胞，其中该经修饰的NK-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)或抗原结合蛋白的核酸，并且其中该抗原结合蛋白特异性结合肿瘤相关抗原。
3.如权利要求2所述的经修饰的NK-92细胞，其中该肿瘤相关抗原选自CD19、CD20、NKG2D配体、CS1、GD2、CD138、EpCAM、HER-2、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、MUC-1、ETA、MAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAP、WT-1、PSMA、NY-ESO1、CSPG-4、IGF1-R、Flt-3、CD276、CD123、BCMA、CD33、B7-H4或4-1BB。
4.如权利要求2所述的经修饰的NK-92细胞，其中该抗原结合蛋白是嵌合抗原
5.如权利要求1所述的经修饰的NK-92细胞，其中该经修饰的NK-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码细胞因子的核酸。
6.如权利要求5所述的经修饰的NK-92细胞，其中该细胞因子是IL-2、erIL-2、IL-15、erIL-15、IL-12或它们的组合。
7.如权利要求5所述的经修饰的NK-92细胞，其中该细胞因子是erIL-2。
8.如权利要求1所述的经修饰的NK-92细胞，其中该经修饰的NK-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码Fc受体的核酸。
9.如权利要求8所述的经修饰的NK-92细胞，其中该Fc受体是CD16或具有SEQ ID NO:12的序列的高亲和力CD16，或是与SEQ ID NO:13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸。
10.如权利要求1所述的经修饰的NK-92细胞，其中该TGF-β阱包含TGF-β受体II胞外域的单链二聚体。
11.如权利要求1所述的经修饰的NK-92细胞，其中特异性结合该PD-L1的该CAR由与SEQID NO:68具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸编码。
...【技术特征摘要】
1.一种经修饰的nk-92细胞，该经修饰的nk-92细胞包含与启动子可操作地连接的编码转化生长因子(tgf)-β阱和嵌合抗原受体(car)的核酸，该嵌合抗原受体特异性结合程序性细胞死亡1配体1(pd-l1)。
2.如权利要求1所述的经修饰的nk-92细胞，其中该经修饰的nk-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码c-x-c趋化因子受体4型(cxcr4)或抗原结合蛋白的核酸，并且其中该抗原结合蛋白特异性结合肿瘤相关抗原。
3.如权利要求2所述的经修饰的nk-92细胞，其中该肿瘤相关抗原选自cd19、cd20、nkg2d配体、cs1、gd2、cd138、epcam、her-2、ebna3c、gpa7、cd244、ca-125、muc-1、eta、mage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c-met、egfr、fap、wt-1、psma、ny-eso1、cspg-4、igf1-r、flt-3、cd276、cd123、bcma、cd33、b7-h4或4-1bb。
4.如权利要求2所述的经修饰的nk-92细胞，其中该抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(car)的一部分。
5.如权利要求1所述的经修饰的nk-92细胞，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：汉斯·G·克林格曼，劳伦·H·布瓦塞尔，约翰·H·李，南森·T·舒默，
申请(专利权)人：南克维斯特公司，
类型：发明
国别省市：
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