单核细胞源性NK细胞制造技术

公开了从全血单核细胞制备脐带血或外周血NK细胞，不需要分离CD34+造血干细胞或NK细胞也不需要饲养层。有利地，本文提出的方法使用富集方法，所述富集方法使用抗CD16激动剂抗体、抗CD3抗体和N‑803。此外，所预期的方法适合于适应成完全自动化的生产方法(盒中GMP)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单核细胞源性NK细胞
本公开涉及产生和培养免疫感受态细胞的组合物、方法和装置，特别是本公开涉及来自全血的脐带血(CB)或外周血(PB)NK细胞。
技术介绍
背景描述包括可用于理解本公开的信息。这不是承认本文提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的专利技术有关，也不是承认明确或隐含引用的任何出版物为现有技术。本文中的所有出版物和专利申请通过引用并入，其程度与每个单独的出版物或专利申请被特别地和单独地指示通过引用并入的程度相同。在并入的参考文件中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用而在该参考文件中该术语的定义不适用。自然杀伤(NK)细胞是一组先天免疫细胞，其常表现为细胞毒性淋巴细胞，所述细胞毒性淋巴细胞通过靶向释放颗粒溶素和穿孔素表现出抗体依赖性细胞毒性。大多数NK细胞具有特异性的细胞表面标记谱(例如，CD3-、CD56+、CD16+、CD57+、CD8+)以及各种活化性和抑制性受体的集合。尽管最近NK细胞已经成为某些癌症治疗的重要组成部分，但由于全血中NK细胞的比例相对较低，产生大量NK细胞(尤其是自体NK细胞)一直是显著的障碍。为了获得治疗上有意义数量的NK细胞和NK样细胞，可以从各种前体细胞产生NK细胞。例如，各种干细胞因子(SCF)、FLT3配体、白细胞介素(IL)-2、IL-7和IL-15已经在各种体外诱导和扩增脐带血源性细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的方法中被报道(AnticancerResearch[抗癌研究]30:3493-3500(2010))。类似地，CD34+造血细胞可以暴露于IL-12和其他药剂，如US2018/0044636中所报道的。在其他方法中，人成血管细胞顺序暴露于两种不同的细胞因子混合物，如WO2011/068896中所述，并且不同的细胞因子混合物与胚胎后造血干细胞一起使用，如WO2012/128622中所教导的。尽管这些方法中的至少一些提供了NK细胞的显著n倍扩增，但用于这种扩增的方法和试剂既需要时间又需要资源。此外，应当指出，许多已知的方法还需要在饲养细胞层上培养NK细胞，这从技术和监管角度来看常常是有问题的。在更简单的方法中，急性髓系白血病(AML)细胞可以暴露于TpoR激动剂，从而诱导AML细胞形成NK细胞。然而，这种方法作为治疗性细胞制剂的来源可能是不可行的。替代方法还依赖于在各种白细胞介素、干细胞因子和FLT3配体存在下培养外周血细胞，如WO2011/103882中公开的。在另一种方法中，US2013/0295671教导了用抗CD16和抗CD3抗体以及细胞因子刺激已经存在的NK细胞的方法。虽然在程序上更简单，但这样的方法仍然需要对细胞进行精细的操作，并且由于所需的特定试剂而大大增加了成本。在进一步已知的方法中，US10,125,351描述了使用脐带血或外周血作为细胞来源，所述细胞进行密度梯度分离以分离有核细胞，然后用含有干扰素、白细胞介素、CD3抗体和人白蛋白的培养基培养所述有核细胞。最有利的是，这样的方法适于在生物反应器中进行灌注培养，因此显著降低了操作困难。然而不幸的是，NK细胞的产量相对较低。因此，即使本领域已知产生大量NK细胞的各种方法，但所有或几乎所有的方法都存在各种缺点。因此，需要提供生产大量NK细胞，特别是自体NK细胞的改进的系统和方法。此外，改进的系统和方法还将允许细胞培养的自动化，并将具有显著减少的试剂需求，以使这种方法在临床上和商业上可行。
技术实现思路
专利技术人已经发现了能够以概念上简单和有效的方式产生和扩增NK细胞的组合物、方法和装置。有利地，NK细胞可以由从脐带或全血获得的血单核细胞(MNC)产生，而不分离CD34+造血干细胞(HSC)或NK细胞，并且不使用饲养层，优选地通过使用N-803和任选的抗CD16激动剂抗体和抗CD3抗体的富集方法。在本专利技术主题的一个方面，专利技术人预期了一种生产NK细胞的方法，所述方法包括从生物流体中分离单核细胞的混合物的步骤，使单核细胞的混合物与抗CD16抗体和N-803接触以活化NK细胞的步骤，以及顺序地向活化的NK细胞供给含有N-803的培养基的另一步骤。在大多数典型的实例中，分离单核细胞的混合物的步骤使用密度梯度离心进行，和/或生物流体是全血或脐带血。因此，单核细胞的混合物一般将包括T细胞、NK细胞、NKT细胞，以及双阴性(DN)T细胞。虽然没有明确排除，但一般优选不对单核细胞的混合物进行富集NK细胞的进一步处理。关于预期的抗CD16抗体，通常优选抗体是对人CD16具有特异性的单克隆抗体。最典型的是，抗CD16抗体以0.05-0.5mcg/ml的浓度存在，和/或N-803以0.1-1.0nM的浓度存在。在需要的情况下，预期的方法还可以包括接触混合物的步骤，所述步骤进一步包括使单核细胞的混合物与抗CD3抗体(例如，在0.1-1.0ng/ml的浓度)接触。在一些实施例中，单核细胞的混合物包含约100-500x106个细胞，和/或以约100-300ml的体积或在约1x106个细胞/ml的细胞密度下进行接触混合物的步骤。优选地但不是必须地，含有N-803的培养基包括人AB血清和/或NKMACSTM培养基(可从米莉生物技术公司(MilenyBiotech),Friedrich-Ebert-Straβe68,51429BergischGladbach,德国购得)和氢化可的松(0.1-5uM)。此外，预期顺序供给的步骤大约每72小时进行，和/或进行顺序供给的步骤直到达到大约0.5-5.0x109个细胞的总细胞数为止。此外，向活化的NK细胞顺序地供给的步骤可以在单个容器中进行，并且接触单核细胞的混合物的步骤可以在同一容器中进行。在其他实施例中，进行向活化的NK细胞顺序地供给的步骤，直到NK细胞富集到至少100倍扩增，和/或直到NK细胞构成所有活细胞的至少约80％或至少约90％。因此，并且从不同的角度来看，专利技术人还预期了一种从单核细胞的混合物扩增NK细胞的方法，所述方法包括提供含有等于或小于5％NK细胞的单核细胞的混合物的步骤。在另一个步骤中，然后将单核细胞的混合物与抗CD16抗体和N-803接触以活化NK细胞，并且在另一个步骤中，向活化的NK细胞供给含有N-803的培养基。优选地但不是必须地，单核细胞的混合物从全血或脐带血获得，或者单核细胞的混合物从相对于接收NK细胞的个体的MHC匹配的自体来源获得。在典型实施例中，含有等于或小于3％NK细胞的单核细胞的混合物，和/或可进一步包含T细胞、NKT细胞和DN细胞。关于培养基、抗CD16抗体、N-803和抗CD3抗体，适用与上述相同的考虑。另外，预期供给步骤包括以大约每72小时的间隔顺序供给，供给步骤进行直到达到约0.5-5.0x109个细胞的总细胞数为止，和/或向活化的NK细胞供给的步骤进行直到NK细胞富集到至少100倍扩增为止。在进一步的实施例中，预期以自动化的方式，优选在单个容器中进行向活化的NK细胞供给的步骤。因此，在本专利技术主题的另一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产NK细胞的方法，所述方法包括：/n从生物流体中分离单核细胞的混合物，并使所述单核细胞的所述混合物与抗CD16抗体和N-803接触以活化NK细胞；并且/n向所活化的NK细胞顺序地供给含有N-803的培养基。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产NK细胞的方法，所述方法包括：
从生物流体中分离单核细胞的混合物，并使所述单核细胞的所述混合物与抗CD16抗体和N-803接触以活化NK细胞；并且
向所活化的NK细胞顺序地供给含有N-803的培养基。


2.如权利要求1所述的方法，其中分离所述单核细胞的所述混合物的步骤使用密度梯度离心进行。


3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物流体是全血或脐带血。


4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中单核细胞的所述混合物包含T细胞、NK细胞、NKT细胞和DNT细胞。


5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中不对单核细胞的所述混合物进行富集NK细胞的进一步处理。


6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗CD16抗体是对人CD16具有特异性的单克隆抗体。


7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物包含约100-500x106个细胞。


8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中接触所述混合物的步骤是以约100-300ml的体积或以约1x106个/ml的细胞密度进行的。


9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗CD16抗体以0.05-0.5mcg/ml的浓度存在。


10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述N-803以0.1-1.0nM的浓度存在。


11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中接触所述混合物的步骤还包括使所述单核细胞的所述混合物与抗CD3抗体接触。


12.如权利要求11所述的方法，其中所述抗CD3抗体以0.1-1.0ng/ml的浓度存在。


13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含有N-803的培养基包含人AB血清。


14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含有N-803的培养基包含NKMACS培养基。


15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述顺序地供给的步骤约每72小时进行一次。


16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行所述顺序地供给的步骤，直到达到约0.5-5.0x109个细胞的总细胞数。


17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在单个容器中进行向所活化的NK细胞顺序地供给的步骤。


18.如权利要求17所述的方法，其中接触所述单核细胞的所述混合物的步骤在所述单个容器中进行。


19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行向所活化的NK细胞顺序地供给的步骤，直到NK细胞富集到至少100倍扩增。


20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行向所活化的NK细胞顺序地供给的步骤，直到NK细胞构成全部活细胞的至少约80％。


21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行向所活化的NK细胞顺序地供给的步骤，直到NK细胞构成全部活细胞的至少约90％。


22.一种从单核细胞的混合物扩增NK细胞的方法，所述方法包括：
提供含有等于或少于5％NK细胞的所述单核细胞的混合物；
使所述单核细胞的所述混合物与抗CD16抗体和N-803接触以活化NK细胞；并且
向所活化的NK细胞供给含有N-803的培养基。


23.如权利要求22所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物从全血或脐带血获得。


24.如权利要求22所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物是相对于接收所述NK细胞的个体从MHC匹配的同种异体来源获得。


25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物包含等于或少于3％NK细胞。


26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物还包含T细胞、NKT细胞和DN细胞。


27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述抗CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗希特·杜加尔，拉吉特·辛哈，李文钊，詹森·艾萨克森，卡尔·马克斯，派翠克·松吉翁，
申请(专利权)人：南克维斯特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US