对消融方案耐受的基因修饰的HSPC制造技术

本发明专利技术提供了基因修饰的造血干细胞或祖细胞(HSPC)以及在干细胞替代疗法中使用HSPC的方法。HSPC经基因修饰以表达受体，该受体赋予所引入的细胞相对于内源性HSPC或未经修饰的对照HSPC的选择性优势。这种受体的存在提供了对用于消除内源性HSPC的免疫治疗方案的耐受性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对消融方案耐受的基因修饰的HSPC相关申请的交叉引用本申请要求2018年11月28日提交的US62/772,545的权益，其出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。序列表的引用本申请包括2019年11月26日创建的大小为11kb的txt文件53950-SEQLST中公开的序列，其通过引用的方式并入本文中。
技术介绍
干细胞通过增殖产生分化的细胞为生物体提供了维持和修复特定组织的手段。造血干细胞移植已用来向患者提供产生血细胞的能力，通常在这种情况下患者已通过化疗或其他调理方案消融了内源性造血干细胞。造血细胞移植通常涉及静脉输注包括造血干细胞在内的自体或同种异体造血细胞。这些造血细胞是从骨髓、外周血或脐带血收集的，并经移植以在骨髓或免疫系统受损或有缺陷的患者中重建造血功能。此过程通常作为治疗的一部分进行，以消除骨髓浸润过程(例如白血病)或纠正先天性免疫缺陷疾病。造血细胞移植还用于允许癌症患者接受比骨髓通常能够耐受的更高剂量的化疗；然后通过用先前收集的干细胞替换骨髓来挽救骨髓功能(通常参见WO2004/002425和WO2018/140940)。专利技术概述本专利技术提供了造血干细胞或祖细胞(HSPC)，其经基因修饰以表达受体，所述受体赋予基因修饰的HSPC在引入受试者时相对于内源性HSPC的选择性增殖优势。任选地，所述细胞是原始干细胞。本专利技术进一步提供了如上文或下文所定义的至少105个HSPC的群体。任选地，至少105个HSPC是CD34+。任选地，所述群体是纯系的(clonal)。任选地，所述群体包括原始干细胞和共同祖细胞。在有些细胞中，所述受体是B2M/MHC-1、PD-L1、CD24、GAS6、CD47、c-Kit中的任一种或多种此类受体的组合。在有些细胞中，所述受体是突变体形式，其中所述突变体相对于所述受体的野生型形式具有与抗体的结合减少。在有些细胞中，受体是CD47或c-Kit。有些细胞经进一步基因修饰以表达功能性人蛋白，使得所述HSPC可以缓解遗传疾病。所述遗传疾病是由于患有所述疾病的受试者中编码人蛋白的基因的突变。在有些细胞中，人蛋白是血红蛋白。一些HSPC通过靶向构建体和内源性基因座之间的同源重组进行基因修饰。在某些HSPC中，基因修饰是杂合的。在某些HSPC中，基因修饰是纯合的。本专利技术提供一种修饰HSPC的方法，其包括向所述HSPC中引入构建体，所述构建体并入HSPC的基因组中，从而形成可表达受体的转录单元，所述受体赋予基因修饰的HSPC相对于修饰前的HSPC的选择性增殖优势。任选地，所述构建体包含转录单元，所述转录单元包含编码所述受体的片段，所述片段与用于其表达的调控序列可操作地连接。任选地，所述构建体与内源性基因座进行同源重组。任选地，所述方法包括将核酸酶引入所述HSPC中，所述核酸酶切割邻近所述同源重组的基因座的基因组DNA，从而刺激所述同源重组。任选地，通过引入编码所述核酸酶的构建体来引入核酸酶，所述构建体在HSPC中表达。本专利技术还提供一种治疗受试者的方法，其包括(a)施用与c-Kit特异性结合的免疫治疗剂，以耗竭表达c-Kit的内源性HSPC；和(b)施用经基因修饰以表达受体的替代性HSPC，所述受体赋予基因修饰的HSPC相对于内源性HSPC的选择性增殖优势，从而抵抗通过所述与c-Kit特异性结合的免疫治疗剂的耗竭，其中所述替代性HSPC至少部分地替代内源性HSPC。任选地，赋予选择性增殖优势的受体是CD47。任选地，所述CD47受体包含突变，并且所述方法还包括施用抗体或SIRPαFc融合蛋白，所述抗体或SIRPαFc融合蛋白以比其与突变的受体结合和对突变的受体与SIRPα的拮抗(如果有的话)更强地与野生型CD47结合和拮抗其与SIRPα的相互作用。任选地，在实行步骤(b)之前内源性HSPC仅部分耗竭。任选地，在步骤(b)之前实行步骤(a)。任选地，与步骤(b)同时或在其之后执行步骤(a)。任选地，当进行所述引入步骤时，所述与c-Kit特异性结合的免疫治疗剂在血清中是可检测的。任选地，所述与c-Kit特异性结合的免疫治疗剂在步骤(b)之前和之后多次施用。任选地，与c-Kit特异性结合的免疫治疗剂是抗体。任选地，所述抗体具有有效促进ADCC或ADP的Fc结构域。任选地，受试者患有血细胞类型的遗传疾病，并且所述替代性HSPC发育成没有所述疾病的类型的血细胞。任选地，替代性HSPC是自体细胞，其已经经进一步基因修饰以没有所述疾病。任选地，遗传疾病是镰状细胞性贫血。任选地，所述受试者患有癌症。任选地，所述癌症是血细胞的癌症，其表达c-Kit或衍生自表达c-Kit的HSPC。任选地，所述受试者患有癌症并且已经接受了抗癌化疗。任选地，受试者在步骤(a)之后接受器官移植。定义受试者包括通过所公开的方法治疗的人类和其它动物，特别是哺乳动物，包括宠物和实验动物，例如小鼠、大鼠、兔。因此，所述方法适用于人类治疗和兽医应用。免疫治疗剂是指抗指定靶标的抗体或Fc融合蛋白。例如，抗CD47抗体和SIRP。-Fc融合蛋白是抗CD47的免疫治疗剂。核酸或氨基酸序列的可操作连接是指序列经连接使得每个序列都可以执行其预期的功能。例如，启动子与编码序列的可操作连接意味着编码序列可以从启动子表达。蛋白质与信号肽的可操作连接意味着信号肽可以引导蛋白质的分泌或靶向蛋白质以并入细胞膜中。功能性核酸或由核酸编码的蛋白质是指核酸的野生型形式，或其天然或诱导的变体，该变体可以支持将核酸表达成蛋白质的受试者的正常生理机能。换句话说，核酸在受试者中的表达不会导致具有部分或完全外显的病理状况。例如，包括对野生型功能不具有任何显著影响的一种或多种变异的野生型核酸或蛋白质的变体将被视为功能性核酸或蛋白质。这与包括突变的核酸或由其表达的蛋白质形成对比，后者在受试者中以杂合或纯合形式的存在与具有部分或完全外显的病理状况的发展相关联。将功能性核酸引入替代性HSPC中，使得能够表达其编码的蛋白质，因此可以至少部分地缓解由内源性HSPC中的核酸和/或蛋白质的突变形式引起的病状。免疫治疗剂通常以独立的形式提供。这意味着这种试剂相对于由于其制备或纯化而产生的干扰蛋白和其他污染物而通常具有至少50％w/w纯度，但不排除该试剂与过量的药物可接受载体或旨在促进其使用的其它载体组合的可能性。有时试剂相对于由制备或纯化产生的干扰蛋白和污染物而具有至少60、70、80、90、95或99％w/w纯度。通常，试剂是其纯化后剩余的主要大分子物质。免疫治疗剂与其靶抗原的特异性结合意味着至少106、107、108、109或1010M-1的亲和力。特异性结合可在数量上可检测地更高，并且可与至少一个不相关靶标发生的非特异性结合区分开。特异性结合可以是特定官能团或特定空间配合(例如，锁和钥匙类型)之间形成键的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。与其靶抗原特异性结合的免疫治疗剂也可以描述为抗其靶抗原。基本的抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种造血干细胞或祖细胞(HSPC)，其经基因修饰以表达受体，所述受体赋予所述基因修饰的HSPC在引入受试者时相对于内源性HSPC的选择性增殖优势。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181128 US 62/772,5451.一种造血干细胞或祖细胞(HSPC)，其经基因修饰以表达受体，所述受体赋予所述基因修饰的HSPC在引入受试者时相对于内源性HSPC的选择性增殖优势。


2.至少105个根据权利要求1的HSPC的群体。


3.根据权利要求2所述的群体，其中所述105个HSPC是CD34+。


4.根据权利要求2所述的群体，其是纯系的(clonal)。


5.根据权利要求2所述的群体，其包括原始干细胞和共同祖细胞。


6.根据权利要求1所述的HSPC，其是原始干细胞。


7.根据权利要求1所述的HSPC，其中所述受体是B2M/MHC-1、PD-L1、CD24、GAS6、CD47、c-Kit中的任一种或多种此类受体的组合。


8.根据权利要求7所述的HSPC，其中所述受体是突变体形式，其中所述突变体相对于所述受体的野生型形式具有与抗体的结合减少。


9.根据权利要求8所述的HSPC，其中所述受体是CD47或c-Kit。


10.根据前述权利要求中任一项所述的HSPC或群体，其中所述HSPC经进一步基因修饰以表达功能性人蛋白，使得所述HSPC能够缓解遗传疾病。


11.根据权利要求10所述的HSPC或群体，其中所述遗传疾病是由于患有所述疾病的受试者中编码人蛋白的基因的突变。


12.根据权利要求11所述的HSPC或群体，其中所述人蛋白是血红蛋白。


13.根据前述权利要求中任一项所述的HSPC或群体，其中所述HSPC通过靶向构建体和内源基因座之间的同源重组进行基因修饰。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的HSPC或群体，其中所述基因修饰是杂合的。


15.根据权利要求1-13中任一项所述的HSPC或群体，其中所述基因修饰是纯合的。


16.一种修饰HSPC的方法，其包括向所述HSPC中引入构建体，所述构建体并入所述HSPC的基因组中，从而形成能表达受体的转录单元，所述受体赋予所述基因修饰的HSPC相对于修饰前的HSPC的选择性增殖优势。


17.根据权利要求16所述的方法，其中所述构建体包含转录单元，所述转录单元包含编码所述受体的片段，所述片段与用于其表达的调控序列可操作地连接。


18.根据权利要求16所述的方法，其中所述构建体与内源基因座进行同源重组。


19.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括将核酸酶引入所述HSPC中，所述核酸酶切割与所述同源重组的基因座的临近的基因组DNA，从而刺激所述同源重组。


20.根据权利要求19所述的方法，其中通过引入编码所述核酸酶的构建体来引入所述核酸酶，所述构建体在所...

【专利技术属性】
技术研发人员：C吉布斯，JP沃克默，IL韦斯曼，
申请(专利权)人：四十七公司，
类型：发明
国别省市：美国;US