经移植前暴露于死亡配体的造血祖细胞的活化制造技术

本发明专利技术涉及通过在移植之前，使细胞暴露于TNF超家族的配体来增强造血干细胞和造血祖细胞的植入以及改善造血干细胞和造血祖细胞的移植结果的方法。本发明专利技术还提供了用于移植的，根据本发明专利技术的方法活化的造血干细胞和造血祖细胞的群。

【技术实现步骤摘要】
经移植前暴露于死亡配体的造血祖细胞的活化本申请是申请日为2014年10月7日，申请号为201480056068.X，专利技术名称为“经移植前暴露于死亡配体的造血祖细胞的活化”的分案申请。
技术介绍
造血干细胞和造血祖细胞移植是肿瘤学中的常规疗法，其在各种耐放射化疗的恶性肿瘤中都具有治疗能力。移植程序的改进和逐步推进，开启了造血移植在非肿瘤疾病中的广泛实施，其中非肿瘤疾病包括先天性缺陷、先天性和获得性免疫缺陷综合征、免疫力异常、自身免疫性疾病，以及对器官和组织移植物的耐受性的诱导。TNF家族包括19种已知的受体/配体相互作用，它们在诱导体细胞凋亡中具有相同的活性。在使用鼠科和人类细胞的应力造血和移植模型中所进行的研究，对肿瘤坏死因子(TNF)家族受体作为细胞凋亡和刺激的双重介质的作用[1-4]，取得了有争议性的证据和解释。一方面，传统观念主要认为这些受体起到细胞凋亡(细胞发育的少数不可逆事件之一)介质的作用。因此，认为Fas/FasL的相互作用是使造血祖细胞发育的负调节因子，类似于在分化末期对克隆扩增进行抑制[5-7]。这一观念是基于如下数据，该数据显示出Fas受体在体外抑制造血祖细胞的功能[8,9]，阻遏克隆形成活性[10,11]，以及损害免疫低下的小鼠[12,13]和人类[11]中的人类细胞植入。有人提出，祖细胞免于发生细胞凋亡是归因于，转导细胞凋亡和抑制信号的TNF家族受体的低水平表达。另一方面，在归巢且接种到受体骨髓内之后不久，就在供体细胞中观察到几种TNF家族受体发生剧烈上调。如WO2007/138597中所记载的，造血祖细胞对细胞凋亡的抗性在移植环境中具有几种重要意义。一方面，WO2007/138597提出作为基于表型进行选择的替代方式，基于功能特性，使用凋亡挑战来富集用于移植的祖细胞。该有效且可靠的选择程序是简单且低廉的，并且在供体移植物中包括了表达低水平或不表达诸如CD34和CD133标记物的祖细胞。此外，基于细胞凋亡的细胞制剂具有以下明显优势：消除了移植物抗宿主(GVHD)的效应物和自身反应性T细胞，以及来自供体移植物的恶性细胞[33,34]。本专利技术人早先曾表明，TNF家族受体在体外对造血细胞功能的负面影响仅限于经细胞因子刺激的骨髓和UCB细胞[8-20,23,27]，而且通过去除细胞因子进一步加剧了该负面影响[35]。在与逐渐丧失植入潜能相关的长期离体培养期间，表达Fas的CD34+祖细胞部分对自发性细胞凋亡显示出过度敏感性[12,13]，然而，这种现象与Fas受体交联无关[28,31]。已表明，移植后祖细胞在体内保持对细胞凋亡的固有抗性，从而使对细胞凋亡不敏感的祖细胞优先植入到被搞糟的骨髓环境中[28]，其中被搞糟的骨髓环境是由移植前调节所造成的损伤导致的。祖细胞的这种特性使得它们成为免疫细胞的有效替代物，用于进行免疫调节，以减轻体内介导排斥反应的宿主抗移植物(HVG)的同种免疫应答，这是通过FasL膜蛋白的异位表达来实现的[36,37]。
技术实现思路
本专利技术涉及通过活化TNF家族受体，来改进造血细胞的植入。与死亡受体的活化不利于造血祖细胞的植入和功能这一传统观念相反的是，本专利技术人证实了，对受体介导的细胞凋亡具有固有抗性的祖细胞中的那些受体的诱导活性。离体暴露于Fas-配体、TNF-α和TRAIL以及它们的组合，增加了SCID小鼠中的定量异嵌合性(quantitativexenochimerism)并且改善了体内骨髓重建。在培养物中，还证明了骨髓祖细胞活性的诱导。对于新鲜的脐带血和经低温保存的动员外周血，示出了具体实施例，以证明造血祖细胞的活化包括普通来源的供体细胞移植物，并且与储存无关。活化不同来源的祖细胞所需的时间和配体浓度是不同的，并且进行了相应优化。根据本专利技术，使供体造血移植物暴露于用于祖细胞活化的TNF超家族配体，以实现优秀的定量和定性的植入和重建。因此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种增加干细胞和祖细胞(SPC)在需要进行SPC移植的受体内的植入的方法，所述方法包括：a.使从供体获得的生物样品与TNF超家族的至少一个成员或其任意片段或衍生物进行离体接触，所述生物样品包括SPC的群；以及b.在所述接触步骤(a)之后，将所述SPC移植到所述受体内；其中，移植的所述SPC显示出增加的植入。另一方面，本专利技术提供了用于移植方法的细胞的群，其中，所述细胞为具有增加的植入特性的干细胞和祖细胞(SPC)，其中，通过使从供体获得的生物样品与TNF超家族的至少一个成员或其任意片段或衍生物进行离体接触，来获得所述具有增加的植入特性的SPC的群，所述生物样品包括SPC的群。附图说明图1A为示出小鼠的存活率的曲线图(n＝20)，该小鼠植入有在培养基中孵育且预暴露于500ng/mlTRAIL的细胞。在此，超过4周的时长中并没有额外的死亡。图1B为示出与250ng/mlFasL嵌合蛋白、20ng/mlTNFα及其组合预孵育的细胞的受体的存活率的曲线图(n＝20)。图1C为示出在移植后3周，在对应实验组(每组中n＝6)中供体嵌合体的水平的图解。图1D为示出小鼠中的品系嵌合体的曲线图，该小鼠植入有预暴露于代表GR-1+骨髓细胞、CD4+和CD8+T细胞以及B220+B淋巴细胞的死亡配体。图2A为演示实验开始的示意图。图2B为示出了通过用人抗-CD45的单克隆抗体对新鲜的UCB(n＝27)，移植前在培养基中孵育24、48和72小时的UCB(n分别＝12、10、5)，在具有FasL的培养基中孵育24、48和72小时的UCB(n分别＝8、8、8)，在具有TNF-α的培养基中孵育24、48和72小时的UCB(n分别＝7、7、5)，以及在具有TRAIL的培养基中孵育24、48和72小时的UCB(n分别＝7、8、9)进行染色，所确定的人类嵌合体百分比的图解。图2C为示出了利用物种特异性CD45对鼠科动物骨髓中的人类细胞嵌合体进行代表性测量的示意图。图3A为在移植后12周，在鼠科动物骨髓中，由人类UCB细胞发育出的谱系的示意图。在移植前，移植细胞与20ng/mlTNF-α进行预孵育：CD34+和阴性(lin-)祖细胞系、CD3+T细胞、CD19+B淋巴细胞、CD33+骨髓细胞。图3B为示出了在细胞移植后12周，骨髓中的人类细胞植入百分比的柱状图，其中细胞与50ng/mlFasL预孵育48小时、与20ng/mlTNF和1.5μg/mlTRAIL预孵育48(每组中n＝7～12)。图3C为示出在预暴露于死亡配体(含有CD14+单核细胞)24～48小时后的定性植入的示意图(每组中n＝4～7)。绘制出了增加的骨髓单细胞部分。图4A是示出了与对照和经TNF-α处理的UCB细胞相比，在首次受体(primaryrecipient)和二次受体(secondaryrecipient)中的植入百分比的图解。图4B是示出了在经TNF或对照(培养基)处理24小时或48小时的UCB细胞的受体中，骨髓集落数目的柱状图。图5A为在培养基中、具有50ng/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于通过活化TNF家族受体活化干细胞和祖细胞(SPC)的亚群的离体方法，其中获得了具有增强的植入特性的SPC的群，其中，所述细胞适合于被移植入需要SPC移植的受体，所述方法包括：/n使从供体获得的生物样品与TNF超家族的至少一个成员或该TNF超家族的至少一个成员的低聚物进行离体接触，所述生物样品包括SPC的群，其中所述增强的植入特性包括提高骨髓、淋巴、血小板或红细胞的重建或活性，其中所述造血SPC的移植改善了受体存活率，其中所述TNF超家族的至少一个成员选自由Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)所组成的组，并且/n其中所述生物样品为脐带血(UCB)并且所述接触持续18小时至48小时；或者/n其中所述生物样品为动员外周血(mPB)并且所述接触持续3小时至18小时。/n

【技术特征摘要】
20131009 US 61/888,7131.一种用于通过活化TNF家族受体活化干细胞和祖细胞(SPC)的亚群的离体方法，其中获得了具有增强的植入特性的SPC的群，其中，所述细胞适合于被移植入需要SPC移植的受体，所述方法包括：
使从供体获得的生物样品与TNF超家族的至少一个成员或该TNF超家族的至少一个成员的低聚物进行离体接触，所述生物样品包括SPC的群，其中所述增强的植入特性包括提高骨髓、淋巴、血小板或红细胞的重建或活性，其中所述造血SPC的移植改善了受体存活率，其中所述TNF超家族的至少一个成员选自由Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)所组成的组，并且
其中所述生物样品为脐带血(UCB)并且所述接触持续18小时至48小时；或者
其中所述生物样品为动员外周血(mPB)并且所述接触持续3小时至18小时。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述SPC为造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)。


3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是新收获的、经保存的或经低温保存的。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述TNF-α的浓度在10ng/ml至20ng/ml之间。


5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述FasL的浓度在10ng/ml至50ng/ml之间。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述TNF超家族的至少一个成员与表面接合。


7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述表面为珠子。


8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述接合经由接头进行。


9.一种用于移...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·亚科尼，
申请(专利权)人：塞莱克特生物疗法有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL