本发明专利技术提供产生去岩藻醣基化抗体的方法、去岩藻醣基化抗体及其组成物，以及用于产生此抗体的细胞。本方法包括将编码岩藻醣基化途径之至少一个经修饰之酵素的核酸导入一宿主细胞中，以于宿主细胞中产生去岩藻醣基化抗体。本发明专利技术方法可轻易地、稳定地且低成本地产生去岩藻醣基化抗体。此外，以本发明专利技术方法所产生之去岩藻醣基化抗体具有增加之ADCC活性，且其不会抑制CDC与安全性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】去岩藻醣基化抗体及其制造专利
本专利技术系有关于一种去岩藻醣基化蛋白，包括有改善的活性及治疗特性之去岩藻醣基化免疫功能分子，以及制备去岩藻醣基化蛋白的方法。专利技术背景醣蛋白涉及人类的许多基本功能，包括催化、信号传导、细胞间的讯息传递以及分子辨识别与结合。许多醣蛋白已被用于治疗的目的，且在过去的二十年中，天然存在的分泌醣蛋白重组形式一直是生技产业的主要产物。范例包括促红血球生成素(erythropoietin，EPO)、治疗性单株抗体(therapeuticmonoclonalantibody，治疗性mAb)、组织纤维溶酶原活化剂(tissueplasminogenactivator，tPA)、干扰素-β(interferon-β，IFN-β)、颗粒细胞-噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)和人类绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotrophin，hCG)。哺乳动物中存在5类抗体，即IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。人类IgG抗体由于其血液中半衰期长与功能特性，如各种效应子功能等，主要用于各种人类疾病的诊断、预防和治疗。人类IgG抗体更可分成以下4种亚类：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。已有许多针对作为IgG类抗体的效应子功能之抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity，ADCC)活性与补体依赖性细胞毒性(complement-dependentcytotoxicity，CDC)的研究，且已报导IgG1亚类的抗体在人类IgG抗体中具有最大的ADCC活性和CDC活性。人类IgG1亚类抗体的ADCC活性和CDC活性的表现需要抗体Fc区与效应细胞，如杀手细胞、自然杀手细胞、活化的巨噬细胞或其类似细胞及各种补体的表面上存在的抗体受体(以下称为「FcγR」)结合。已显示抗体铰链区及C区(以下称为「Cγ2结构域(domain)」)中第2结构域之许多胺基酸残基，以及链接至Cγ2结构域的醣链对于此结合反应是重要的。降低或抑制抗体或Fc融合蛋白的N-多醣的岩藻醣基化可增强ADCC活性。ADCC一般参与自然杀手(naturalkiller，NK)细胞的活化，且依赖抗体包覆细胞经NK细胞表面上Fc受体的辨识。Fc区域与NK细胞上Fc受体的结合会受Fc区域醣基化状态的影响。此外，在Fc区域的N-多醣类型也会影响ADCC活性。因此，对于抗体组成物或Fc融合蛋白组成物，可藉由增加去岩藻醣基之N-多醣的相对量来增加对FcγRIII结合亲和力，或组成物的ADCC活性。许多可影响醣基化的因子，包含物种、组织及细胞类型，均已显示对于醣化的发生方式非常重要。此外，细胞外环境，通过改变培养条件，如血清浓度，可直接对醣基化产生影响。已提出各种方法，来改变在特定宿主生物体中达到的醣基化模式，包括导入或过度表现与产生寡醣有关之某些酵素(U.S.Pat.No.5,047,335；U.S.Pat.No.5,510,261)。这些方案并不局限于胞内的方法((U.S.Pat.No.5,278,299)。WO98/58964描述抗体组成物，其中大致上所有的N端-连接的寡醣皆为G2寡醣。G2系指具有两个终端Gal，且没有NeuAcs的分歧(biantennary)结构。WO99/22764提到大致上没有在CH2结构域中具有N端-连接之G1、G0或G-1寡醣的醣蛋白的抗体组成物。G1系指具有一个Gal，且不具有NeuAcs的分歧结构，G0系指其中不具有末端NeuAcs或Gals的分歧结构，且G-1系指核心单元少一个GlcNAc。WO00/61739报导的是，与73％的由NSO(小鼠骨髓瘤)细胞表现的抗体相比，47％的由YB2/0(大鼠骨髓瘤)细胞表现的抗-hIL-5R抗体具有α1-6岩藻醣连接的醣链。由不同宿主细胞表现的αhIL-5R抗体的岩藻醣相对比例为YB2/0＜CHO/d＜NSO。WO02/31140与WO03/85118显示可藉由利用RNAi抑制α1，6-岩藻醣基转移酶的功能，来控制与醣链结合之岩藻醣的修饰。使用细胞生产抗体组成物的方法，其包括使用抗凝集素的细胞，凝集素辨识醣链，其中岩藻醣的第1位置透过复合的N-醣苷连接的醣链中的α-键，结合至还原端中N-乙酰葡萄醣胺的第6位置。醣链的结构在人类IgG1亚类抗体的效应功能上扮演非常重要的角色，且藉由改变醣链结构，来制备具有更强效应功能的抗体可以是可能的。然而，醣链的结构多样且复杂，且醣链生理角色解决方案仍不足且昂贵。因此，需要一种生产去岩藻醣基化抗体的方法。参考文献1.PAULSON，James，etal.，“Processforcontrollingintracellularglycosylationofproteins”USPatentNo.5，047，335(1991)2.GOOCHEE，CharlesF.，etal.，“Methodofcontrollingthedegradationofglycoproteinoligosaccha1idesproducedbyculturedChinesehamsterovarycells”USPatentNo.5，510，261(1996)3.WONG，Chi-Huey，etal.，“Methodandcompositionforsynthesizingsialylatedglycosylcompounds”USPatentNo.5，278，299(1994)4.RAJU，T.，Shantha，“Methodsandcompositionsforgalactosylatedglycoproteins”WO/1998/058964(1998)5.RAJU，T.，Shantha，“Methodsandcompositionscomprisinggalactosylatedglycoproteins”WO/1999/022764(1999)6.HANAI，Nobuo，etal.，“Methodforcontrollingtheactivityofimmunologicallyfunctionalmolecule”WO/2000/061739(2000)7.KANDA，Yutaka，etal.，“cellsproducingantibodycompositions”WO/2002/031140(2002)8.BLUMBERG，R.S.，eta1.，“Centralairwayadministrationforsystemicdeliveryoftherapeutics”WO03/077834(2002)9.BLUMBERG，R.S.，eta1.，“Centralairwayadministrationforsystemicdeliveryoftherapeutics”USPatentApplica本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具低岩藻醣基化的重组细胞，包括一编码岩藻醣基化途径中一经修饰之酵素的核酸序列。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种具低岩藻醣基化的重组细胞，包括一编码岩藻醣基化途径中一经修饰之酵素的核酸序列。
2.如权利要求1所述的重组细胞，其中该经修饰之酵素源自于GDP-甘露醣4，6-脱水酶(GDP-mannose4，6-dehydratase，GMD)、GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露醣异构酶-还原酶(GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannoseepinierase-reductase，FX)、或岩藻醣转移酶(fucosyltransferase，FUT)。
3.如权利要求1所述的重组细胞，其中该经修饰之酵素源自于岩藻醣转移酶(FUT)。
4.如权利要求1所述的重组细胞，其中该经修饰之酵素源自于α-1，6-岩藻醣转移酶(FUT8)。
5.如权利要求1所述的重组细胞，其中该核酸序列择自于下列所组成之群组：SEQIDNOs：3、5、7、9、11、15及其任何组合。
6.如权利要求1所述的重组细胞，其中该经修饰之酵素具有一胺基酸序列，其择自于下列所组成之群组：SEQIDNOs：4、6、8、10、12、16及其任何组合。
7.如权利要求1所述的重组细胞，其中该经修饰之酵素于该宿主细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭文君，陈惠蓉，
申请(专利权)人：联合生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71
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