基于MSC的基因重组细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开基于MSC的基因重组细胞的制备方法，包括：S101：把IL‑35、IL‑22、FGF1的编码基因分别克隆到一个带有跨膜区结构的真核表达载体pDisplay中，形成IL‑35、IL‑22、FGF1细胞膜表面展示质粒(pDIL35、pDIL22、pDFGF1)；S102：制备hUC‑MSC细胞；S103：把pDIL35、pDIL22、pDFGF1质粒等量混合转染进MSC细胞，产生MSCd12235细胞。本发明专利技术把多个有已知生物学活性的细胞因子表达在一个功能细胞表面，形成具有新型生物学功能的基因重组细胞。功能细胞为活性因子提供了一个固相化的作用表面，活性因子赋予原有细胞新的功能并应用在糖尿病的治疗中。

【技术实现步骤摘要】
基于MSC的基因重组细胞的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及基于MSC的基因重组细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。也是一种常见的内分泌系统疾病，是由于体内的胰岛素的缺乏，或是胰岛素本身质量及其他原因造成其不能发挥正常生理作用，而引起的以糖代谢为主的糖、脂肪、蛋白质三大物质代谢混乱的一种综合病症。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病主要分为四型：I型糖尿病(T1DM)、II型糖尿病(T2DM)、妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病。在糖尿病的干细胞治疗中，除了采用诱导分化制备胰岛β细胞外的直接作用外，来自脐、骨髓、脂肪等组织的间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSC)在T1D和T2D及糖尿病并发症都有一定的疗效。MSC治疗糖尿病的机理主要是通过其分泌的多种具有免疫抑制性质的细胞因子(MCP-1,IL-6等)的旁分泌作用而发挥作用的，包括促进胰岛β细胞再生，抑制炎症和改善胰岛素抵抗，提高胰岛β细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于MSC的基因重组细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS101：把IL-35、IL-22、FGF1的编码基因分别克隆到一个带有跨膜区结构的真核表达载体pDisplay中，形成IL-35、IL-22、FGF1细胞膜表面展示质粒(pDIL35、pDIL22、pDFGF1)；/nS102：制备hUC-MSC细胞；/nS103：把pDIL35、pDIL22、pDFGF1质粒等量混合转染进MSC细胞，产生MSCD12235细胞。/n

【技术特征摘要】
1.基于MSC的基因重组细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101：把IL-35、IL-22、FGF1的编码基因分别克隆到一个带有跨膜区结构的真核表达载体pDisplay中，形成IL-35、IL-22、FGF1细胞膜表面展示质粒(pDIL35、pDIL22、pDFGF1)；
S102：制备hUC-MSC细胞；
S103：把pDIL35、pDIL22、pDFGF1质粒等量混合转染进MSC细胞，产生MSCD12235细胞。


2.根据权利要求1所述的基于MSC的基因重组细胞的制备方法，其特征在于，在所述的S101中，包括：
S1011：构建IL-35膜表面展示质粒(pDIL35)；
S1012：构建IL-22膜表面展示质粒(pDIL22)；
S1013：构建FGF1膜表面展示质粒(pDFGF1)。


3.根据权利要求2所述的基于MSC的基因重组细胞的制备方法，其特征在于，在所述的S1011中，包括：
S10111：引物设计
1)引物1IL35EBI3upSacII:GACGTCCCGCGGatgaccccgcagcttctcctg；
2)引物2IL35EBI3dnSalI:GACGTCGTCGACcttgcccaggctcattgtggca；
3)引物3IL35IL12AupBglII:GACGTCAGATCTatggtcagcgttccaacagcc；
4)引物4IL35IL12AdnSalI:GACGTCGTCGACggcggagctcagatagcccat；
S10112：制备RNA：采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞(PBMC)，再用TRIzol试剂制备总RNA；
S10113：RT-PCR：
1)以总RNA为模版，引物1和引物2为引物，用InvitrogenSuperScriptIV一步法RT-PCR试剂盒制备IL35EBI3基因片段，用EZSpin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
2)以总RNA为模版，引物3和引物4为引物，用InvitrogenSuperScriptIV一步法RT-PCR试剂盒制备IL35IL12A基因片段，用EZspin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
S10114：限制性内切酶消化pDisplay载体及PCR产物
1)分别用SacI/SalI及BglII/SalI限制性内切酶消化pDisplay载体，用EZ-10SpinColumnDNAPAGEGelExtractionKit分别纯化，获得pDisplaySacII/SalI及pDisplayBglII/SalI2个酶切载体产物；
2)分别用SacII/SalI限制性内切酶消化IL35EBI3基因片段，用BglII/SalI限制性内切酶消化IL35IL12A基因片段，用EZ-10SpinColumnDNAPAGEGelExtractionKit分别纯化，获得IL35EBI3基因SacII/SalI片段及IL35IL12A基因BglII/SalI片段2个酶切基因产物；
S10115：连接
1)用DNA连接酶连接pDisplaySacII/SalI及IL35EBI3基因SacII/CalI片段，获得pD-IL35EBI3产物；
2)用DNA连接酶连接pDisplayBglII/SalI及IL35IL12A基因BglII/SalI片段，获得pD-IL35IL12A产物；
S10116：转染感受态菌：
用pD-IL35EBI3产物及pD-IL35IL12A产物分别转染DH5α感受态细菌；
S10117：挑菌落及验证：
挑阳性菌落，小量培养，提取质粒DNA，用相应限制性内切酶切进行初选，最后测序确认。保存pD-IL35EBI3及pD-IL35IL12A重组菌；
S10118：培养pD-IL35EBI3及pD-IL35IL12A重组菌，制备pD-IL35EBI3及pD-IL35IL12A重组质粒。


4.根据权利要求2所述的基于MSC的基因重组细胞的制备方法，其特征在于，在所述的S1012中，包括：
S10121：引物设计
1)引物5IL22upBglII:GACGTCAGATCTatggccgccctgcagaaatct；
2)引物6IL22dnSalI:GACGTCGTCGACaatgcaggcatttctcagaga；
S10122：制备RNA:
采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞(PBMC)，再用TRIzol试剂制备总RNA；
S10123：RT-PCR
以总RNA为模版，引物5和引物6为引物，用InvitrogenSuperScriptIV一步法RT-PCR试剂盒制备Il-22基因片段，用ESSpin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
S10124：限制性内切酶消化pDisplay载体及PCR产物
1)用BglII/SalI限制性内切酶消化pDisplay载体，用EZ-10SpinColumnDNAPAGEGelExtractionKit纯化，获得pDisplayBglII/SalI酶切载体产物；
2)用BglII/SalI限制性内切酶消化IL-22基因片段，用EZ-10SpinColumnDNAPAGEGelExtractionKit分别纯化，获得IL-22基因BglII/SalI片段酶切基因产物；
S10125：连接:用DNA连接酶连接pDisplayBglII/SalI及IL-22基因BglI...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明杰，马云坤，
申请(专利权)人：深圳市汉科生命工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44