iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用技术

本发明专利技术涉及皮肤修复技术领域，具体而言，涉及iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用；本发明专利技术提供的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体应用于皮肤损伤修复效果良好，且效果稳定。含有本发明专利技术制备方法制备的诱导多能干细胞来源外泌体的iPSC来源外泌体修复剂在皮肤损伤修复的效果佳，且效果稳定。

【技术实现步骤摘要】
iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用
本专利技术涉及皮肤修复
，具体而言，涉及iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用。
技术介绍
干细胞(stemcell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在特定条件下，可以分化为多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能，被称为“万用细胞”。皮肤处于人体的最外层，能够让机体免受病原体的侵害，是人体最大的一个器官。皮肤组织经常发生不同程度的损伤，如机械性损伤、烧伤、烫伤以及糖尿病足引起的溃疡等急性或者慢性的损伤，这不仅影响了个人的身体健康，还给社会带来了巨大的经济负担。相关技术中将干细胞应用于皮肤修复与再生，其主要依靠旁分泌的方式来促进皮肤的损伤后修复。外泌体作为干细胞的旁分泌因子，其能够促进成纤维细胞的增殖以及迁移、调节炎症反应以及抑制瘢痕形成等方面来促进皮肤损伤后的修复与再生。但是，相关技术提供的外泌体在皮肤损伤修复中的作用不佳，且效果不稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用，iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体的皮肤损伤修复作用良好，且效果稳定，含有诱导多能干细胞来源外泌体的iPSC来源外泌体修复剂的皮肤损伤修复作用良好，且效果稳定。>本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术提供一种iPSC来源外泌体的制备方法，包括：用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞；将培养出的诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；培养纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将第一上清液离心，得到第二上清液；收集第二上清液离心，得到第三上清液；将第三上清液离心。在可选的实施方式中，加入仙台病毒重悬细胞于离心后的间充质干细胞后，将其接种于Matrigel。在可选的实施方式中，将培养出的诱导多能干细胞纯化处理，包括：将培养出的诱导多能干细胞培养一段时间后，取单克隆至Matrigel中继续培养，在单克隆的密度达到70％-90％时，消化传代培养。在可选的实施方式中，将第一上清液离心时的温度为3℃-5℃；和/或，将第二上清液离心时的温度为3℃-5℃；和/或，将第三上清液离心时的温度为3℃-5℃。第二方面，本专利技术提供一种iPSC来源外泌体修复剂，iPSC来源外泌体修复剂的原料包括：羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸、羟乙基纤维素和前述实施方式任一项的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体。在可选的实施方式中，iPSC来源外泌体修复剂的制备方法包括：将羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸和水混合、溶解，再添加羟乙基纤维素，混合；灭菌后添加诱导多能干细胞来源外泌体。在可选的实施方式中，iPSC来源外泌体修复剂的原料按照重量百分比计包括：0.5％-1％的羟丙基壳聚糖、10％-20％的甘油、5％-10％的聚乙二醇和0.1％-1％的山梨酸，余量为水。在可选的实施方式中，羟乙基纤维素的质量占羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸和水的总重量的2.5-6％。在可选的实施方式中，诱导多能干细胞来源外泌体的质量占羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸、水和羟乙基纤维素的总重量的1％-3％。第三方面，本专利技术提供如前述实施方式任一项的iPSC来源外泌体的制备方法制备的iPSC来源外泌体在皮肤损伤修复中的应用。本专利技术的iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用的有益效果包括：本专利技术实施例提供的iPSC来源外泌体的制备方法包括：用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞；将培养出的诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；培养纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将第一上清液离心，得到第二上清液；收集第二上清液离心，得到第三上清液；将第三上清液离心。本专利技术的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体应用于皮肤损伤修复效果良好，且效果稳定。含有上述制备方法制备的诱导多能干细胞来源外泌体的iPSC来源外泌体修复剂在皮肤损伤修复的效果佳，且效果稳定。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例1中的iPSC的免疫荧光结果图；图2为本专利技术实施例1中的iPSC来源外泌体WB结果图；图3为本专利技术实施例1中的iPSC来源外泌体电镜分析结果图；图4为本专利技术实施例1中的iPSC来源外泌体促进成纤维细胞的增殖结果图；图5为本专利技术实施例1中的iPSC来源外泌体促进成纤维细胞的迁移结果图；图6为本专利技术实施例1中的iPSC来源外泌体促进SD大鼠的伤口愈合结果图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术实施例的iPSC来源外泌体的制备方法包括：用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞(iPSC)；将培养出的诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；培养纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将第一上清液离心，得到第二上清液；收集第二上清液离心，得到第三上清液；将第三上清液离心。本专利技术的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，包括：/n用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的所述间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的所述间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞；/n将培养出的所述诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；/n培养所述纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将所述第一上清液离心，得到第二上清液；收集所述第二上清液离心，得到第三上清液；将所述第三上清液离心。/n

【技术特征摘要】
1.一种iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，包括：
用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的所述间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的所述间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞；
将培养出的所述诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；
培养所述纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将所述第一上清液离心，得到第二上清液；收集所述第二上清液离心，得到第三上清液；将所述第三上清液离心。


2.根据权利要求1所述的iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，加入所述仙台病毒重悬细胞于离心后的所述间充质干细胞后，将其接种于Matrigel。


3.根据权利要求1所述的iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，将培养出的所述诱导多能干细胞纯化处理，包括：将培养出的所述诱导多能干细胞培养一段时间后，取单克隆至Matrigel中继续培养，在所述单克隆的密度达到70％-90％时，消化传代培养。


4.根据权利要求1所述的iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，将所述第一上清液离心时的温度为3℃-5℃；和/或，
将所述第二上清液离心时的温度为3℃-5℃；和/或，
将所述第三上清液离心时的温度为3℃-5℃。
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄国滨，周红艳，李爱群，鲁浩，龚春丽，葛圆圆，
申请(专利权)人：珠海乐维再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44