一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法，涉及基因表达调控技术领域，包括依次进行的如下步骤，先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的nestin‑i gRNA和引导转录激活子的nestin‑a gRNA中的任意一种。该方法简单，脱靶率低，且能在细胞株中稳定表达。克服了运用传统方法构建稳定细胞株的弊端，能够在短期获得稳定细胞株。

A method of regulating nestin gene expression in neural stem cells and targeting cells

【技术实现步骤摘要】
一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法
本专利技术涉及基因表达调控
，具体而言，涉及一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法。
技术介绍
nestin基因的蛋白编码产物为NESTIN。NESTIN是第6类中间丝蛋白，也被称为巢蛋白，其分子量大小为220KDa-250KDa，其位于1号染色体中。nestin基因在结构上由3个内含子和4个外显子组成。NESTIN蛋白在结构上主要分为N端(1-7aa)、α螺旋区(8-313aa)以及C端(314-1621aa)，其中α螺旋区又细分为4个部分，分别是1A，1B，2A和2B。胚胎发育过程中nestin基因呈现广泛表达，其最早表达是在胚胎的单细胞神经外胚层上。此外，nestin还在多种细胞中表达，如新生血管内皮细胞、中肾间质细胞等，但在神经系统中nestin的表达是最丰富的。中枢神经系统发育在哺乳动物早期发育过程中是一个十分重要的事件，该过程表现为细胞的迁移以及细胞形态的变化，NESTIN作为一种中间丝蛋白，被作为神经干细胞的标记分子，对于神经干细胞的自我更新起着十分重要的作用。尽管Nestin在神经系统发育中起着重要的作用，但是其具体的影响以及作用机制尚不明确，因此阐明Nestin在神经系统发育中的分子机理显得十分必要。对于基因的研究常见于在细胞中过表达或者沉默靶基因，观察靶基因在细胞命运改变中发挥的作用，而实现基因的过表达或者沉默主要有瞬时表达和稳定表达两类。其中，瞬时表达中外源DNA不会整合到基因组中，但是瞬时表达只能维持短短的几天时间；稳定表达中外源基因与基因组整合，能够在细胞中持续表达。传统的建立稳定细胞株通常通过瞬时转染的方式以及结合基因载体上的抗性基因进行筛选最终获得稳定细胞株，这样的方式存在工作时间长、效率低的问题，此外由于Nestin基因序列比较长，运用传统的方式建立稳定过表达细胞株比较困难，因此有必要建立一种新型的Nestin基因过表达或沉默的gRNA靶点序列。CRISPR/Cas9是一种操纵基因组的技术，在引导RNA的指导下，Cas9能够靶向基因组中特定区域并对DNA进行切割，从而造成DNA双链断裂。CRISPR/Cas9常用于对基因组进行编辑。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，该方法简单，脱靶率低，且能在细胞株中稳定表达。克服了运用传统方法构建稳定细胞株的弊端，能够在短期获得稳定细胞株。这将更有利于研究Nestin基因在神经系统发育中的生物学功能及其具体的作用机制，对于我们认识神经干细胞的生命规律具有重要的指导意义。本专利技术的另一目的在于提供一种靶向细胞的方法，该方法能够精确靶向细胞，对细胞进行转录前的基因调控。本专利技术是这样实现的：一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，包括依次进行的如下步骤，先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的nestin-igRNA和引导转录激活子的nestin-agRNA中的任意一种。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述nestin-igRNA的序列如序列1-12所示，nestin-agRNA的序列如序列13-24所示，nestin-igRNA的序列可以是如序列1-12所示的任意一种或多种的组合，nestin-agRNA的序列可以是如序列13-24所示的任意一种或多种的组合。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述nestin-igRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点下游1-112bp范围内，nestin-agRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点上游1-450bp范围内。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述方法还包括使用293T细胞进行病毒包装，具体包括先对293T细胞进行均匀分散，将PEI混合液加入到质粒混合液中制得质粒-PEI混合液，再将质粒-PEI混合液加入含有239T细胞的培养基中共培养，浓缩收集病毒。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述使用293T细胞进行病毒包装后进行细胞的感染和筛选，具体包括如下步骤：先准备病毒混合液，再往生长状态良好的神经干细胞中加入制备好的病毒液混合液，共培养。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述细胞的感染后分别进行nes基因的表达水平检测和NESTIN蛋白水平的检测，其中，nes基因的表达水平检测所用的检测nes基因的引物如序列26-27所示。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述方法包括过表达神经干细胞中nestin基因或沉默神经干细胞中nestin基因。一种负载分子，包含有nestin基因的gRNA，nestin基因的gRNA的序列如序列1-24所示的任意一种或者多种的组合。一种靶向细胞的方法，包括使细胞与负载分子接触，负载分子包含有nestin基因的gRNA，负载分子包含无催化活性结构域的dCas9，dCas9的序列如序列25所示，nestin基因的gRNA的序列如序列1-24所示，细胞是神经干细胞，新生血管内皮细胞和中肾间质细胞中的任意一种。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述负载分子还包含有抗生素，抗生素是嘌呤霉素，潮霉素，罗红霉素，螺旋霉素，阿奇霉素，克拉霉素，万古霉素，链霉素，庆大霉素，四环素，多西环素，米诺环素，卡那霉素，氨苄青霉素和氯霉素中的任意一种或多种的组合；优选的，抗生素为嘌呤霉素，潮霉素。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，该方法可以用于内源性过表达或沉默nestin基因的gRNA靶点序列，克服了运用传统方法构建稳定细胞株的弊端，且脱靶率低，能够在短期获得稳定细胞株。这将更有利于研究Nestin基因在神经系统发育中的生物学功能及其具体的作用机制，对于我们认识神经干细胞的生命规律具有重要的指导意义。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为gRNA位置及nestin基因的结构图；图2为gRNA-a组神经干细胞nestin基因mRNA的qRT-PCR结果图(Control组代表稳定表达lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2细胞；gRNAa1代表稳定表达lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa1细胞；gRNAa2代表稳定表达lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa2细胞；gRNAa3代表稳定表达lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa3细胞；gRNAa4代表稳定表达lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa4细胞；gRNAa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，包括依次进行的如下步骤：先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，所述nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的nestin‑i gRNA和引导转录激活子的nestin‑a gRNA中的任意一种。

【技术特征摘要】
1.一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，包括依次进行的如下步骤：先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，所述nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的nestin-igRNA和引导转录激活子的nestin-agRNA中的任意一种。2.根据权利要求1所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，所述nestin-igRNA的序列如序列1-12所示，所述nestin-agRNA的序列如序列13-24所示，所述nestin-igRNA的序列可以是如序列1-12所示的任意一种或多种的组合，所述nestin-agRNA的序列可以是如序列13-24所示的任意一种或多种的组合。3.根据权利要求1所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，所述nestin-igRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点下游1-112bp范围内，所述nestin-agRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点上游1-450bp范围内。4.根据权利要求1所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，还包括使用293T细胞进行病毒包装，具体包括先对293T细胞进行均匀分散，将PEI混合液加入到质粒混合液中制得质粒-PEI混合液，再将质粒-PEI混合液加入含有239T细胞的培养基中共培养，浓缩收集病毒。5.根据权利要求4所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄国滨，周红艳，李爱群，鲁浩，龚春丽，郑妍明，周珊珊，
申请(专利权)人：珠海乐维再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44