KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂技术

本发明专利技术公开了KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂。本发明专利技术公开的一种KGF蛋白外泌体的制备方法运用了CRIPSRa技术，高效激活了干细胞KGF基因的表达水平，而后对高表达KGF的干细胞进行外泌体的富集，在不改变内源基因组的前提下选择性地高表达KGF基因。本发明专利技术还提供一种毛发护理剂，该毛发护理剂包括上述KGF蛋白外泌体的制备方法制备得到的KGF蛋白外泌体干粉和调配后的滋养液，该毛发护理剂作用于脱发部位，能够修复受损毛囊以及激活毛囊干细胞，从根本上促进毛发的生长，适用于雄性激素性脱发、精神压力引起的脱发、遗传性脱发以及烫染损伤等多种脱发疾病。

【技术实现步骤摘要】
KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂。
技术介绍
干细胞在再生领域具有广泛的运用，随着对干细胞的研究逐步深入，越来越多的研究表明干细胞对于毛发的再生具有重要的作用，毛发的生长受到毛囊干细胞以及毛囊组织微环境的调控。人类毛发的生长是一个动态的周期循环，可分为三个阶段，包括生长期、退化期以及休止期。健康人群的毛囊有85％左右处于生长期，而脱发患者有30％甚至以上的毛囊处于休止期。处于休止期时候毛发会自动脱落，在休止期过后，毛囊重新回到生长期，新的毛发重新生长出来，这样周而复始直到毛囊发生萎缩。当大量的毛发陷入休止期时候，毛发则无法生长，最终造成脱发。毛囊能够如此周而复始，其原因是在毛囊底部存在毛囊干细胞。在大多数的脱发疾病中，由于调控毛囊生长的细胞因子含量降低，大量的毛囊停滞在休止期，不能进入生长期，最终导致毛发停止生长。目前已知脱发类型较多，如遗传性脱发、化学物质脱发及营养性脱发等等，其中遗传性脱发也就是雄性激素性脱发是比较常见的类型，对于雄性激素性脱发的治疗常使用米诺地尔酊外擦，口服非那雄胺或度他雄胺，但是会带来不可避免的副作用。外泌体是细胞在特定刺激条件下分泌产生的40-100nm的细胞外盘状囊泡，是细胞间相互沟通与影响的重要工具，外泌体作为细胞的信号分子，可直接进入细胞，影响细胞功能。干细胞分泌的外泌体中含有多种生长因子，如干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)以及角质细胞生长因子(KGF)等，外泌体进入靶细胞后，能够与细胞相互作用，介导细胞间的信号转导，这些因子不仅能够修复受损的毛囊，激活毛囊干细胞的生长，对于调控生物体内组织器官的正常生理代谢具有十分重要的作用。基于外泌体的安全性以及有效性，越来越多的研究发现外泌体对于多种疾病的治疗具有很好的效果，被用于作为治疗疾病的新型手段。近年来，外泌体在生发领域的研究也逐渐出现，将外泌体运用于脱发的治疗也有相关的报道。诱导多能干细胞(iPSC)最初由日本科学家山中伸弥实现，将人的成体细胞通过病毒载体将四个转录因子组合导入到体细胞中，从而获得类似胚胎状态的多功能细胞。iPSC具有较多的优点，可以无限更新增殖和分化成为特定组织的细胞，还避免了由于个体差异产生的免疫排斥，与胚胎干细胞相比，iPSC也避免了伦理方面的争论，因此iPSC在生物医学领域具有广阔的应用前景。角质细胞生长因子(KGF)属于成纤维母细胞生长因子家族，又称为FGF-7，其主要由间质细胞产生，KGF与受体KGFR特异结合从而发挥多种生物学功能，促进细胞的生长增殖、促进创伤的愈合以及参与组织器官的发育，如，刺激毛母质细胞和毛囊干细胞的增殖及分化，促进毛囊的发育。KGF在临床应用上具有重要意义，但是仍存在一些问题。在制备重组rhKGF蛋白方面，存在蛋白表达量低以及稳定性较差等问题，导致价格昂贵。研究人员也尝试在真核细胞中过表达KGF，从而提高细胞中KGF的含量，但是，运用传统的过表达手段获得稳定高表达KGF细胞株难免会造成外源DNA整合到基因组中，造成不可预测的影响。此外，传统的过表达手段存在效率低耗时长等问题。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种KGF蛋白外泌体的制备方法，该方法能够高效激活干细胞KGF基因的表达水平，对高表达KGF的干细胞进行外泌体的富集，同时又需要避免由于外源基因在基因组的随机插入造成的不可预测的影响。本专利技术的另一个目的在于提供一种毛发护理剂，该毛发护理剂应当包括KGF蛋白外泌体，能够作用于脱发部位，并从根本上促进毛发的生长。本专利技术是这样实现的：本专利技术提供了一种KGF蛋白外泌体的制备方法，所述制备方法包括，构建具有KGF过表达能力的细胞株，再培养所述细胞株，从培养液中分离得到KGF蛋白外泌体，所述具有KGF过表达能力的细胞株中包含至少两个具有不同插入序列的重组质粒，所述插入序列包括dCas9-转录激活子序列或引导序列。所述转录激活子序列包括序列SEQIDNo.13，所述引导序列编辑gRNA序列，所述引导序列包括由单链DNA退火得到的双链DNA，所单链DNA序列包括以下六组序列中的一组：第一组序列包括SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；第二组序列包括SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；第三组序列包括SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；第四组序列包括SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；第五组序列包括SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；第六组序列包括SEQIDNo.11和SEQIDNo.12。传统的过表达手段为通过细胞编程，改变iPSC干细胞的基因组成，从而使得其稳定、高效的表达出目的蛋白，但经过细胞编程的细胞株会造成外源DNA整合到基因组的情况发生，整合结果的安全性很难预测，因此，本申请采用了含有KGF基因的转录激活子序列和引导序列的重组质粒，通过转录激活子促进KGF基因的表达水平的提高，而不改变iPSC干细胞的基因组成，从而避免了潜在的安全性风险。优选地，所述干细胞包括iPSC干细胞。iPSC干细胞最早于2006年，由日本科学家山中伸弥团队利用逆转录病毒将4个转录因子转入成体细胞进而实现了“生命时钟”的逆转，将其转变为诱导多能干细胞。近年来，随着iPSC干细胞技术不断改进，iPSC干细胞在多种疾病治疗中均展现出了应用潜力，本专利技术即利用促进iPSC干细胞过表达KGF蛋白而实现KGF蛋白外泌体的制备。引导序列编辑表达的gRNA能够与KGF基因转录起始位置区域结合，从而引导转录激活子序列靶向结合于KGF转录起始位置，促进KGF基因过表达。gRNA序列的选择具有多样性，由于染色体的空间结构以及表观遗传调控等多种因素导致不同的gRNA序列与KGF基因转录起始位置不同区域结合的程度存在差异，最终使引导的转录激活子靶向KGF基因存在差异。本专利技术提供的六组gRNA序列都能引导转录激活子序列靶向到KGF基因上，并且其中第三组gRNA序列在空间结构等因素下能够更好地与KGF基因转录起始位置结合，高效引导转录激活子靶向KGF基因取得比其他组更好的效果。优选地，所述重组质粒的原始质粒包括含有引导序列质粒和含有dCas9-转录激活子质粒。进一步优选地，所述重组质粒包括质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A和质粒lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro。lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro质粒中自带KGF基因的转录激活子序列SEQIDNo.13(5'-GACGCATTGGACGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAGTGACGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACCTCGACATGCTCGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种KGF蛋白外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，构建具有KGF过表达能力的细胞株，再培养所述细胞株，从培养液中分离得到KGF蛋白外泌体，所述具有KGF过表达能力的细胞株中包含至少两个具有不同插入序列的重组质粒，所述插入序列包括dCas9-转录激活子序列或引导序列，所述转录激活子序列包括序列SEQ ID No.13，所述引导序列编辑gRNA序列，所述引导序列包括由单链DNA退火得到的双链DNA；/n所述单链DNA的序列包括以下六组序列中的一组：/n第一组序列包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；/n第二组序列包括SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；/n第三组序列包括SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；/n第四组序列包括SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；/n第五组序列包括SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；/n第六组序列包括SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。/n

【技术特征摘要】
1.一种KGF蛋白外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，构建具有KGF过表达能力的细胞株，再培养所述细胞株，从培养液中分离得到KGF蛋白外泌体，所述具有KGF过表达能力的细胞株中包含至少两个具有不同插入序列的重组质粒，所述插入序列包括dCas9-转录激活子序列或引导序列，所述转录激活子序列包括序列SEQIDNo.13，所述引导序列编辑gRNA序列，所述引导序列包括由单链DNA退火得到的双链DNA；
所述单链DNA的序列包括以下六组序列中的一组：
第一组序列包括SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；
第二组序列包括SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；
第三组序列包括SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；
第四组序列包括SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；
第五组序列包括SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；
第六组序列包括SEQIDNo.11和SEQIDNo.12。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞株包括干细胞；优选地，包括iPSC干细胞。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒包括含有引导序列质粒和含有dCas9-转录激活子质粒；
进一步优选地，所述重组质粒包括质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A和质粒lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A的构建方法包括设计合成gRNA序列，根据gRNA序列合成单链DNA序列，经退火后得到对应的双链DNA序列，该双链DNA序列在连接酶的作用下，连接于酶切后的质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2上，得到重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A。


5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒还经过病毒包装；优选地，所述病毒包装选用293T细胞；
优选地，所述重组质粒在进行病毒包装前还需要进行重组质粒的扩增和/或鉴定；
优选地，所述重组质粒的扩增包括将重组质粒转化进DH5α感受态细胞中进行培养；
优选地，所述重组质粒的鉴定包括提取扩增后的重组质粒进行基因测序，并确定测序结果中包括引导序列或转录激活子序列；
优选地，在培养所述细胞株之前还包括细胞株的筛选；
优选地，所述细胞株的筛选包括，采用含有细胞毒素的培养基对含有重组质粒的细胞株进行培养，所述的细胞毒素与重组质粒具有的抗性相对应；
优选地，所述细胞毒素包括嘌呤霉素和/或潮霉素B。


6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的KGF蛋白外泌体采...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄国滨，周红艳，李爱群，鲁浩，葛圆圆，龚春丽，修治，
申请(专利权)人：珠海乐维再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44