碱性成纤维细胞生长因子的提取方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及提取碱性成纤维细胞生长因子的方法。特别是从水稻、生菜、烟草等植株中工业化提取高纯度碱性成纤维细胞生长因子。通过该法可以实现碱性成纤维细胞生长因子稳定的产业化提取，广泛适用于各种材料来源。

【技术实现步骤摘要】
碱性成纤维细胞生长因子的提取方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及提取碱性成纤维细胞生长因子的方法。
技术介绍
早在1940年，Hoftman等在脑和垂体的抽提物中发现一种能够促进成纤维细胞生长的物质。该物质1974年被命名为成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)。因对酸和热敏感，等电点呈碱性(pI＝9.6)，又被称之为碱性FGF(bFGF，或FGF-2)。后来人们发现成纤维细胞生长因子(FGFs)包含一个大的家族，其均参与细胞生长和分化，并且在无脊椎动物和脊椎动物中广泛存在。成纤维细胞生长因子家族中被研究最透彻的两个成员是酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。先发现的bFGF和aFGF(FGF-1也称为内皮细胞生长因子，等电点为酸性，pI＝5.6)与后发现的FGF-5、FGF-6、角质细胞生长因子(KGF/FGF-7)、hst-1/kfgf、int-2等同属于FGF家族，该家族共同特点是由35-55％氨基酸序列保守性的蛋白质组成。与其他家族成员不同，aFGF和bFGF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.碱性成纤维细胞生长因子的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1：取含有碱性成纤维细胞生长因子的样品，组织破碎或收集表达产物，离心收集上清液，澄清离心，获得样品溶液；/n步骤2：取所述样品溶液过滤，收集滤液，经阳离子交换层析，收集含有碱性成纤维细胞生长因子的目的洗脱峰，得到蛋白液1；/n步骤3：取所述蛋白液1经疏水层析，收集含有碱性成纤维细胞生长因子的目的洗脱峰，得到蛋白液2；/n步骤4：取所述蛋白液2经排阻层析，收集含有碱性成纤维细胞生长因子的目的洗脱峰，得到蛋白液3；/n步骤5：取所述蛋白液3经膜过滤，收集滤液。/n

【技术特征摘要】
1.碱性成纤维细胞生长因子的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取含有碱性成纤维细胞生长因子的样品，组织破碎或收集表达产物，离心收集上清液，澄清离心，获得样品溶液；
步骤2：取所述样品溶液过滤，收集滤液，经阳离子交换层析，收集含有碱性成纤维细胞生长因子的目的洗脱峰，得到蛋白液1；
步骤3：取所述蛋白液1经疏水层析，收集含有碱性成纤维细胞生长因子的目的洗脱峰，得到蛋白液2；
步骤4：取所述蛋白液2经排阻层析，收集含有碱性成纤维细胞生长因子的目的洗脱峰，得到蛋白液3；
步骤5：取所述蛋白液3经膜过滤，收集滤液。


2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子为牛或人的碱性成纤维细胞生长因子；优选地，所述含有碱性成纤维细胞生长因子的样品的原材料为生菜、烟草或水稻，进一步优选地，所述含有碱性成纤维细胞生长因子的样品为瞬时表达牛或人碱性成纤维细胞生长因子的生菜或烟草。


3.如权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，当所述样品为瞬时表达牛或人碱性成纤维细胞生长因子的生菜、烟草、水稻等植物材料时，所述上清液的制备方法为：将所述样品与预冷至4℃的提取缓冲液按照1g:1～20ml的质量体积比混合后匀浆，将匀浆后的组分在8000～12000×g下离心20～60min收集上清液；优选地，所述质量体积比为1g:2～5ml，所述离心条件为11000×g离心30min。


4.如权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，当所述样品为杆状病毒表达系统或CHO哺乳动物细胞表达系统时，所述上清液的制备方法为：将所述样品的细胞培养上清在8000～12000×g下离心10～60min收集上清液；优选地，所述离心条件为8000×g离心10-20min。


5.如权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述样品为生菜、水稻或烟草时，所述提取缓冲液成分为纯化水、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、乙酸盐缓冲液、乙二胺四乙酸/乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、维生素C、苯甲基磺酰氟、吐温、甘油、糖类中的一种或两者以上的组合；
所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.0～8.5，浓度为0～100mM，优选20～50mM；
所述Tris-HCl缓冲溶液pH值为6.0-9.0，浓度为0～100mM，优选0～20mM；
所述乙酸盐缓冲液的pH值为3.5.0-6.0，浓度为0～100mM，优选0～50mM；
所述乙二胺四乙酸/乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的浓度为0-10mM，优选0～5mM；
所述维生素C(Vc)的浓度为0～150mM，优选0～60mM；
所述苯甲基磺酰氟(PMSF)的终浓度为0～20mM，优选0～5mM；
所述吐温选自吐温20或吐温80，优选吐温80；浓度为0～1％，优选0～0.05％；
所述甘油的终浓度为0～15％，优选0～5％；
所述糖类为葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、海藻糖的一种或两者以上的组合，所述糖类的终浓度为0～30％，优选0～10％。


6.如权利要求1至5任一项所述的提取方法，其特征在于，所述澄清离心为：向所述上清液中加入pH调节剂调节pH值至3.5～8.5，再加入NaCl，静置后离心；
所述pH调节剂包括酸性缓冲液或碱性缓冲液；
所述酸性缓冲液为pH3.5～4.5的乙酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，优选为0.5～1.5mol/L、pH3.5～4.5的乙酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，最优选为1.0mol/L、pH3.8的乙酸盐缓冲液；
所述碱性缓冲液为0.5-1.5mol/L、pH7.0～10.0的Tris-HCl缓冲液，优选为1mol/L、pH9.0的Tris-HCl缓冲液；
所述NaCl的终浓度为0.1～0.5mol/L，优选为0.15～0.3mol/L；
所述离心为8000-16000×g离心10-60min；
所述离心结束后还包括膜过滤的步骤，优选用0.45μm膜过滤。


7.如权利要求1至6任一项所述的提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，
申请(专利权)人：王跃驹，
类型：发明
国别省市：美国;US