【技术实现步骤摘要】
一种携带有GCH1基因突变的诱导多能干细胞及分化为神经前体细胞的制备方法
[0001]本专利技术涉及诱导多能干细胞分化
,具体而言,涉及一种携带有GCH1基因突变的诱导多能干细胞及分化为神经前体细胞的制备方法。
技术介绍
[0002]诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells,iPSC),由日本科学家山中伸弥首次通过病毒载体将四个转录因子组合后导入到体细胞(皮肤成纤维细胞、血液细胞等)中,获得类似胚胎状态的多功能细胞。iPSC具有无限自我更新增殖能力,可以分化成特定的功能细胞甚至是组织、器官等。iPSC分化成特定组织的细胞不仅避免了由于个体差异产生的免疫排斥现象,而且更重要的是与胚胎干细胞相比,iPSC也避免了伦理方面的争论,因此iPSC在生物医学领域具有广阔的应用前景,是生物医药行业重要的生命资源和医疗资源,在个人储存与应用、疾病模型、药物研发、细胞治疗、精准医疗和健康管理等领域方面发挥着无可替代的作用,有着巨大的市场需求。
[0003]干细胞与基因编辑技术被公认为治疗疾病、延缓人类衰老的新方向。脑衰老和脑疾病,特别是阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统疾病日益威胁着我国的经济发展。
[0004]在人类孟德尔遗传学数据库中记载,GCH1(GTP Cyclohydrolase 1)基因是伴随或不伴高苯丙氨酸血症的多巴反应性肌张力障碍和四氢生物蝶呤缺乏性高苯丙氨酸血症B型的致病基因。其中,多巴胺反应性肌张力障碍(DRD)是一种罕见的神经系统代谢肌张力障碍疾病。该病典型 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种携带有GCH1基因突变的诱导多能干细胞的制备方法,其特征在于,其包括:对离体的携带GCH1基因突变的人外周血单核细胞进行细胞重编程,从而获得携带有GCH1基因突变的多能干细胞;然后将所述携带有GCH1基因突变的多能干细胞与携带调节表达盒的病毒和携带反应表达盒的病毒混合培养,获得携带有GCH1基因突变的诱导多能干细胞;所述调节表达盒包括特异性启动子和反义四环素激活子,所述反应表达盒包括TRE、四环素诱导型启动子、转录因子编码基因和筛选基因;所述细胞重编程包括:将携带c
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Myc基因、SOX2基因、KLF4基因和OCT4基因的仙台病毒感染所述离体的携带GCH1基因突变的人外周血单核细胞,并培养至获得所述GCH1基因突变的多能干细胞;所述GCH1基因突变为GCH1基因的T209R。2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在将所述离体的携带GCH1基因突变的人外周血单核细胞与仙台病毒混合前,还包括将人外周血单核细胞在扩增培养基中进行扩增培养;所述扩增培养基为含有20
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30ng/ml IL3、20
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30ng/ml IL6、100
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150ng/ml SCF和100
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150ng/ml FLT3的StemPro
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34完全培养基;优选地,扩增培养4
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5天后将培养后的细胞进行铺板,并加入Matrigel以用于后续的病毒感染。3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述转录因子编码基因包括hNGN2基因;所述筛选基因选自eGFP基因、YFP、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和新霉素基因中的至少一种;所述特异性启动子选自UBC启动子;所述四环素诱导型启动子选择CMV启动子。4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述仙台病毒的滴度MOI为KOS:c
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Myc:KLF4=5:5:2.5~3。5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述携带调节表达盒的病毒和携带反应表达盒的病毒混合的比例为1:1
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1.1;并加入终浓度为8
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10μg/ml的聚凝胺进行培养;优选地,经携带调节表达盒的病毒和携带反应表达盒的病毒感染所述多能干细胞40
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48h后更换为400
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420μg/ml G418的StemFlex完全培养基培养7
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10天,更换为200
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220μg/ml G418的StemFlex完全培养基培养继续培养获得携带有GCH1基因突变的诱导多能干细胞。6.如权利要求1
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5任一项所述的制备方法制得的携带有GCH1基因突变的诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法,其特征在于,其包括:将所述诱导多能干细胞在神经前体细胞诱导培养基中进行诱导,使诱导多能干细胞向神经前体细胞分化。7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述神经前体细胞诱导培养基为含Thx的N2基础培养基和B27培养基;培养时间为13
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15天。8.如权利要求6
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7任一项所述的制备方法制得的神经前体细胞分化为NGN2神经元的方法,其特征在于,其包括:将神经前体细胞接种至Matrigel处理后的平板中,以含有终浓度为2
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2.2μM的Thx和1
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1.2ug/ml Dox的NPC培养基培养,然后更换为含Dox的NPC培养基培养,再更换为含有Dox的神经培养基,培养9
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10天,期间进行换液,然后更换为神经培养基,继续培养7
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10天。9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述神经培养基为含有50
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60nM Ara
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C培养基。10.如权利要求1
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5任一项所述的制备方法制得的携带有GCH1基因突变的诱导多能干
细胞分化为中脑多巴胺神经元的方法,其特征在于,其包括:将诱导多能干细胞接种至中脑多巴胺神经元分化培养基中进行培养;优选地,将诱导多能干细胞接种至Matrigel处理后的平板中,以含有THX的StemFlex完全培养基进行培养,然后在分化当天将StemFlex完全培养基更换为含终浓度为10
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12μM的ALK抑制剂以及100
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110nM的BMP I受体激酶抑制剂的KSR基础培养基进行培养,然后更换为含终浓度10
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12μM的ALK抑制剂、100
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【专利技术属性】
技术研发人员:黄国滨,周红艳,李爱群,鲁浩,龚春丽,陈传云,葛圆圆,
申请(专利权)人:珠海乐维再生医学科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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