使用RNA引导的核酸内切酶进行DNA构建体整合的改进工艺制造技术

公开了一种用于开发基因工程化细胞的改进的、更安全的和商业上有效的工艺。更具体地，公开了一种工艺，其包括将供体DNA构建体、向导RNA和RNA引导的核酸酶与待转染的宿主细胞接触；以及将所述三种组分引入到所述宿主细胞中。进一步公开了一种供体DNA构建体，其被设计成用于将CAR(嵌合抗原受体)插入到宿主细胞的确定的基因组位点中。此外，本公开提供了一种用缺乏可能存在安全问题的病毒载体的CAR转染的宿主细胞。本公开提供了用于工程化T细胞以表达CAR构建体的更有效且更具成本效益的工艺。艺。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用RNA引导的核酸内切酶进行DNA构建体整合的改进工艺
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2019年3月11日提交的美国临时专利申请第62/816,836号和2019年9月17日提交的美国临时专利申请第62/901,735号的优先权，所述申请都以全文引用的方式并入。
专利

[0003]本公开提供了使用RNA引导的核酸内切酶(如cas蛋白)将感兴趣的DNA序列有效整合到靶DNA分子(如宿主基因组)中的方法和组合物。

技术介绍

[0004]非常需要将外源DNA序列靶向整合到基因组基因座中。CRISPR
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Cas基因组工程化是一种敲除基因功能，或精确敲入DNA序列以进行基因校正或基因标记的快速且相对简单的方式。靶向基因敲除是通过使用Cas9核酸酶和向导RNA(gRNA)在DNA中产生双链断裂(DSB)来实现的。然后通过内源性非同源末端连接(NHEJ)修复途径通过随机插入或缺失(插入缺失(indel))对DSB进行修复，通常是不完美修复。对于敲入实验，除了Cas9核酸酶和gRNA外，还需要DNA供体模板，并且本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在两个不同基因座处遗传修饰原代人T细胞的方法，其包括向原代人T细胞中引入：包含第一RNA引导的核酸内切酶和第一向导RNA的第一核糖核蛋白(RNP)；包含第二RNA引导的核酸内切酶和第二向导RNA的第二RNP；和包含至少两个核酸修饰的供体DNA分子；其中所述第一向导RNA包含被设计成与靶DNA中第一基因座处的第一靶位点杂交的靶向序列，并且所述供体DNA在所述第一靶位点处插入到所述靶DNA分子中；进一步其中所述第二向导RNA包含被设计成与所述靶DNA中第二基因座处的第二靶位点杂交的第二靶向序列，所述杂交导致在所述第二靶位点处引起突变。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个核酸修饰在所述供体DNA分子的一条链上。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中一个或多个核酸修饰是对所述供体DNA分子的修饰链的5'端的10个核苷酸内的一个或多个核苷酸或核苷酸键的修饰。4.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个核酸修饰是骨架修饰。5.根据权利要求4所述的方法，其中一个或多个核酸修饰是硫代磷酸酯修饰或亚磷酰胺修饰，或其组合。6.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个核酸修饰是核碱基的修饰或取代。7.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个核酸修饰是糖的修饰或取代。8.根据权利要求7所述的方法，其中一个或多个核酸修饰是脱氧核糖的2'
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甲基修饰。9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述供体DNA分子是双链DNA分子。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述供体DNA分子在与所述修饰链相对的链上具有5'末端磷酸酯。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述供体分子在所述供体分子的所述修饰链的5'末端的十个核苷酸内的骨架上具有一至三个硫代磷酸酯修饰，并且在所述供体分子的所述修饰链的5'末端的十个核苷酸内具有一至三个2'
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甲基核苷酸修饰。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述供体分子在所述供体分子的所述修饰链的5'末端的五个核苷酸内的骨架上具有一至三个硫代磷酸酯修饰，并且在所述供体分子的所述修饰链的5'末端的五个核苷酸内具有一至三个2'
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甲基核苷酸修饰。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体DNA分子包括同源臂，所述同源臂位在用于整合到基因组中的序列的两侧。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述同源臂中的至少一个的长度为50至2000个核苷酸。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述同源臂中的至少一个的长度为140至660个核苷酸。16.根据权利要求13所述的方法，其中所述同源臂中的至少一个的长度为140至250个核苷酸。17.根据权利要求13所述的方法，其中所述供体DNA分子包含修饰链和相对链，其中所述修饰链包含两个或更多个核酸修饰，并且所述相对链包含末端磷酸酯。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体DNA的长度为约500至约5000bp。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述供体DNA的长度为约500至约3500bp。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体DNA包含嵌合抗原受体(CAR)或二聚抗原受体(DAR)构建体。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和/或所述第二RNA引导的核酸内切酶是Cas9。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一和/或所述第二RNA引导的核酸内切酶是Cas12a。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一和所述第二RNA引导的核酸内切酶是Cas12a。24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一RNA引导的核酸内切酶是Cas12a并且所述第二RNA引导的核酸内切酶是Cas9，或其中所述第一RNA引导的核酸内切酶是Cas9并且所述第二RNA引导的核酸内切酶是Cas12a。25.根据权利要求1所述的方法，其中同时引入所述第一RNP和所述供体DNA。26.根据权利要求25所述的方法，其中将所述第一RNP、所述供体DNA和所述第二RNP同时引入到所述细胞中。27.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第一RNP和所述供体DNA同时引入到所述细胞中，并且将所述第二RNP在不同时间引入到所述细胞中。28.根据权利要求27所述的方法，其中将所述RNP通过电穿孔或脂质体转移引入到所述细胞中。29.一种工程化的原代T细胞，其包含：在包含RNA引导的核酸酶的第一靶位点的第一基因座处整合到基因组中的非天然遗传构建体，以及在包含RNA引导的核酸酶的第二靶位点的第二基因座处的突变，其中所述工程化的原代T细胞通过根据权利要求1至28中任一项所述的方法产生。30.一种用遗传构建体转染的原代人T细胞群体，其中所述细胞群包含具有在第一基因座处整合到基因组中的非天然遗传构建体的细胞，并且进一步在第二基因座处的基因中具有突变，其中所述群体的至少25％的细胞表达所述遗传构建体并且展现所述第二基因座处所述基因的表达减少。31.根据权利要求30所述的原代人T细胞群体，其中所述第一RNA引导的核酸内切酶靶位点和所述第二RNA引导的核酸内切酶位点是Cas12a靶位点。32.根据权利要求30所述的人T细胞群体，其中所述第一RNA引导的核酸内切酶靶位点是Cas12a靶位点并且所述第二RNA引导的核酸内切酶位点是Cas9靶位点。33.根据权利要求30所述的人T细胞群体，其中所述第一RNA引导的核酸内切酶靶位点是Cas9靶位点并且所述第二RNA引导的核酸内切酶位点是Cas12a靶位点。34.一种将供体DNA定点整合到靶DNA分子中的方法，其包括：向细胞中引入：包含Cas12a核酸内切酶和工程化向导RNA的RNP；和包含至少两个核酸修饰的供体DNA分子；其中所述向导RNA包含被设计成与所述靶DNA中的靶位点杂交的靶向序列，并且所述供
体DNA在所述靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁蓓蓓，郭文忠，张延良，
申请(专利权)人：索伦托药业有限公司，
类型：发明
国别省市：