原代NK CAR构建体和方法技术

本文披露了重组核酸，所述重组核酸包含5’非翻译(5’‑UTR)序列部分、信号肽序列部分、单链抗体片段序列部分、铰链区序列部分、跨膜结构域序列部分和一个或多个细胞内结构域序列部分。本文还披露了包含上述重组核酸的经修饰的自然杀伤(NK)细胞。本文进一步披露了通过施用所述经修饰的NK细胞在受试者中治疗肿瘤的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原代NKCAR构建体和方法序列表序列表的ASCII文本文件的内容名为104077.00016Pro_ST25，其大小为42KB，创建于在2019年11月6日，并通过EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，通过引用以其全文并入。
本专利技术的领域是重组核酸和包含其的细胞，特别是因为它们涉及癌症治疗。
技术介绍
背景描述包括可用于理解本专利技术的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的专利技术相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。近年来，基于自然杀伤(NK)细胞的癌症免疫疗法取得了显著进展。NK细胞是细胞毒性淋巴细胞，其构成先天免疫系统的重要组分。在大多数情况下，NK细胞占循环淋巴细胞的约4％-10％、并结合并杀伤靶向细胞，包括病毒感染的细胞和许多恶性细胞。NK细胞杀伤对特定抗原没有特异性，可以在没有既往免疫敏化的情况下发生。靶向细胞的杀伤通常由细胞溶解蛋白(包括穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素)介导。NK细胞已经用作治疗实体。为此，从全血的外周血淋巴细胞级分中分离出NK细胞，在细胞培养物中扩增以获得足够数量的细胞，然后将其重新输注至受试者中。在至少某些情况下，NK细胞在离体疗法和体内治疗中均显示出中等有效性。然而，癌症采用各种策略来延迟、改变甚至停止抗肿瘤免疫，这导致控制肿瘤生长的失败。NK细胞的抗肿瘤应答也面临很多限制。首先，NK细胞到达肿瘤组织的能力差限制了它们作为针对实体瘤的疗法的应用。这是细胞免疫疗法策略的普遍问题。其次，肿瘤中NK细胞活化受体及其配体的变化可能导致治疗应答降低和肿瘤进展。例如，在结直肠癌的早期阶段检测到高水平的NKG2D(自然杀伤细胞2，成员D)配体，但随着疾病的进展，它们的表达下降。第三，肿瘤微环境(TME)仍然是过继转移的NK细胞的有效性的主要障碍。例如，嵌入细胞外基质的肿瘤浸润免疫细胞(例如树突细胞(DC)、抑制性或致耐受性巨噬细胞)和调节性T(Treg)细胞以及与癌症相关的成纤维细胞，可能会通过分泌免疫抑制性细胞因子或通过干扰受体表达来干涉NK细胞的活化。因此，在本领域中仍然需要克服以上问题并且能够修饰NK细胞以特异性靶向癌细胞的技术和方法。
技术实现思路
本专利技术的主题涉及重组核酸，其包含T7启动子序列部分、5’非翻译(5’-UTR)序列部分、信号肽序列部分、单链抗体片段序列部分、铰链区序列部分、跨膜结构域序列部分和一个或多个细胞内结构域序列部分。所述重组核酸可进一步包含编码CD64的序列。此外，5’-UTR序列部分可以进一步包含科扎克序列。优选地，单链抗体片段序列部分包含编码适于结合PDL1抗原或其他肿瘤抗原的单链可变片段的序列。在一些实施例中，重组核酸可进一步包含编码CD16a和/或ER-IL2的序列部分。铰链序列部分为单链抗体片段序列部分提供了运动范围，而跨膜结构域序列部分使得能够将重组核酸插入膜中。如本文所披露的重组核酸的细胞内结构域序列部分预期包含共刺激或信号传导序列部分。在一个实施例中，细胞内结构域序列部分包含CD28和/或CD3ζ。在另一个实施例中，细胞内结构域序列部分包含CD28和/或FcεRIγ。如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，此外，细胞内结构域序列部分可以提供增强的针对肿瘤细胞的细胞毒性活性。优选地，本披露的重组核酸包含3’非翻译区(3’-UTR)和聚A序列部分。所述3’-UTR序列部分提供RNA稳定性和翻译起始。所述聚A序列部分优选包含至少150个腺嘌呤核苷酸。所述聚A序列部分提供RNA稳定性和翻译起始。优选地，优化本披露的重组核酸载体以靶向肿瘤抗原。在一些实施例中，重组核酸与SEQIDNO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在其他实施例中，重组核酸与SEQIDNO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在又其他实施例中，重组核酸与SEQIDNO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在又另外实施例中，重组核酸与SEQIDNO：4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在本专利技术主题的另一方面，专利技术人已经披露了包含一种或多种核酸的经修饰的NK细胞，所述一种或多种核酸编码：5’非翻译(5’-UTR)序列部分、信号肽序列部分、单链抗体片段序列部分、铰链区序列部分、跨膜结构域序列部分和一个或多个细胞内结构域序列部分；其中所述核酸序列作为单个多核苷酸彼此可操作地连接。预期该经修饰的NK细胞特异性靶向肿瘤细胞。在另一方面，专利技术人已经披露了产生经修饰的NK细胞或CAR-NK细胞的方法，所述方法包括：用如上披露的重组核酸转染原代NK细胞。此外，还披露了包含经修饰的NK细胞和药学上可接受的赋形剂的组合物。此外，可以在试剂盒中提供经修饰的NK细胞；例如，试剂盒可包含本文披露的NK细胞和使用说明书。在又另一方面，披露了治疗受试者的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的经修饰的NK细胞或包含经修饰的NK细胞的组合物，其中施用治疗癌症或减少所述受试者的肿瘤的大小。还预期了减少患者癌症转移的方法，其中向患有癌症转移的受试者施用治疗有效量的经修饰的NK细胞或包含经修饰的NK细胞的组合物。优选地，将1×103至1×1010个NK细胞/m2施用于受试者。施用可以肠胃外、静脉内、瘤周或通过输注进行。所述方法还可以包括向受试者进一步施用另外的治疗剂。在另一个实施例中，专利技术人已经披露了在有需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文披露的任何一种经基因修饰的NK细胞，从而治疗所述癌症。所述方法可以进一步包括施用至少一种另外的治疗实体的步骤，所述另外的治疗实体选自由以下组成的组：病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、N-803、抗体、干细胞移植物和肿瘤靶向细胞因子。所述癌症选自白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。根据优选实施例的以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组核酸，所述重组核酸包含：/nT7启动子序列部分、5’非翻译(5’-UTR)序列部分、信号肽序列部分、单链抗体片段序列部分、铰链区序列部分、跨膜结构域序列部分和一个或多个细胞内结构域序列部分。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组核酸，所述重组核酸包含：
T7启动子序列部分、5’非翻译(5’-UTR)序列部分、信号肽序列部分、单链抗体片段序列部分、铰链区序列部分、跨膜结构域序列部分和一个或多个细胞内结构域序列部分。


2.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述信号肽序列部分进一步包含编码CD64的序列。


3.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述5’-UTR序列部分进一步包含科扎克序列。


4.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述单链抗体片段序列部分包含编码适于结合PDL1抗原或其他肿瘤抗原的单链可变片段的序列。


5.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述铰链序列部分为所述单链抗体片段序列部分提供了运动范围。


6.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述跨膜结构域序列部分使得能够将所述重组核酸插入膜。


7.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述细胞内结构域序列部分包含共刺激或信号传导序列部分。


8.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述细胞内结构域序列部分包含CD28和/或CD3ζ。


9.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述细胞内结构域序列部分包含CD28和/或FcεRIγ。


10.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述细胞内结构域序列部分提供了增强的针对肿瘤细胞的细胞毒性活性。


11.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸进一步包含3’非翻译区(3’-UTR)。


12.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述3’-UTR序列部分提供RNA稳定性和翻译起始。


13.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸进一步包含聚A序列部分。


14.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述聚A序列部分包含至少150个腺嘌呤核苷酸。


15.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述聚A序列部分提供RNA稳定性和翻译起始。


16.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中所述载体靶向肿瘤抗原。


17.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸进一步包含编码CD16a的序列部分。


18.如前述权利要求中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸进一步包含编码ER-IL2的序列部分。


19.如权利要求1所述的重组核酸，所述重组核酸与SEQIDNO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。


20.如权利要求1所述的重组核酸，所述重组核酸与SEQIDNO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。


21.如权利要求1所述的重组核酸，所述重组核酸与SEQIDNO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。


22.如权利要求1所述的重组核酸，所述重组核酸与SEQIDNO：4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。


23.一种经修饰的NK细胞，所述经修饰的NK细胞包含一种或多种编码以下的核酸：
5’非翻译(5’-UTR)序列部分、信号肽序列部分、单链抗体片段序列部分、铰链区序列部分、跨膜结构域序列部分和一个或多个细胞内结构域序列部分；
其中所述核酸序列作为单个多核苷酸彼此可操作地连接。


24.如权利要求23所述的经修饰的NK细胞，其中所述细胞特异地靶向肿瘤细胞。


25.如权利要求23至24中任一项所述的经修饰的NK细胞，其中所述经修饰的NK细胞特异性靶向PDL1或其他肿瘤抗原。


26.如权利要求23至25中任一项所述的经修饰的NK细胞，其中所述信号肽序列部分进一步包含编码CD64的序列。


27.如权利要求23至26中任一项所述的经修饰的NK细胞，其中所述单链抗体片段序列部分包含编码适于结合PDL1抗原或其他肿瘤抗原的单链可变片段的序列。


28.如权利要求23至27中任一项所述的经修饰的NK细胞，其中所述铰链序列部分为所述单链抗体片段序列部分提供了运动范围。


29.如权利要求23至28中任一项所述的经修饰的NK细胞，其中所述跨膜结构域序列部分使得能够将所述重组核酸插入膜。


30.如权利要求23至29中任一项所述的经修饰的NK细胞，其中所述细胞内结构域序列部分包含共刺激或信号传导序列部分。


31.如权利要求23...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗希特·杜加尔，费雷什特·帕尔维兹，
申请(专利权)人：南克维斯特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US