基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于SARS‑CoV‑2假病毒的中和抗体检测方法。本发明专利技术还涉及一种重组载体，一种类病毒颗粒，以及一种细胞株。本发明专利技术还涉及检测SARS‑CoV‑2类病毒感染力的方法以及检测SARS‑CoV‑2抗体中和活性的方法。本申请的所构建的细胞株能够稳定、高效的应用于假病毒感染力检测以及抗体中和活性检测中，且降低了检测成本。

【技术实现步骤摘要】
基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法
本专利技术涉及基因工程和分子生物学领域，具体涉及一种基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法。本专利技术还涉及一种重组载体，一种类病毒颗粒，以及一种细胞株。本专利技术还涉及检测SARS-CoV-2类病毒感染力的方法以及检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法。
技术介绍
假病毒(pseudovirus)是病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的异源核酸形成的类似于真病毒的具有感染性的病毒颗粒，由于被包裹的核酸不具有复制形成病毒的全部核酸序列，所以假病毒只有一轮的感染力，操作比较安全。高滴度的假病毒是保持实验稳定性的重要因素。假病毒的滴度提高除了对膜蛋白基因序列进行改造优化外，也可对假病毒感染的细胞进行改造，以提高病毒的感染效率。Furin是一种存在于全部的脊椎动物和部分无脊椎动物中的I型跨膜蛋白，由794个氨基酸组成；包括N端信号肽(signalpeptide)、前肽(propeptide)、催化域(catalyticdomain)、保守的P结构域、富含Cys的结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。Furin能够切割前体蛋白，对维持细胞内环境的稳定至关重要。除此之外，Furin还被许多病毒和细菌所利用，与某些疾病的发生息息相关。而SARS-CoV-2在S1内(核苷酸位置23619-23632)具有独特的4个氨基酸插入(681-PRRA-684)，这种插入(PRRA)为Furin提供了潜在的识别和切割位点，使SARS-CoV-2S蛋白的切割效率显著提高。SARS-CoV-2也利用血管紧张素转换酶2(ACE2)作为受体与宿主细胞表面结合。SARS-CoV-2假病毒中和抗体检测方法中，需要一种能够提高SARS-CoV-2假病毒的感染效率的方法，以减少病毒使用量，且稳定、高效、且成本小的SARS-CoV-2假病毒中和抗体检测方法。
技术实现思路
本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，构建了表达或过表达ACE2蛋白和Furin蛋白的细胞株。进一步的，应用该细胞株建立了稳定、高效，且低成本的检测SARS-CoV-2类病毒感染力的方法以及检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种重组载体，其含有编码ACE2蛋白和/或Furin蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述ACE2蛋白和Furin蛋白为天然的哺乳动物(例如，人)的ACE2蛋白和Furin蛋白。在某些实施方案中，所述ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。在某些实施方案中，所述Furin蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些实施方案中，本专利技术的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在某些实施方案中，所述载体能够在宿主细胞(例如哺乳动物的细胞，例如人的细胞)内表达本专利技术的蛋白或如上所述的融合蛋白。在某些实施方案中，所述重组载体为表达载体。在某些实施方案中，所述重组载体由质粒构建。在某些实施方案中，所述质粒选自pLV，pcDNA3.1+、pCAG3.1和pCMV3.1。在某些实施方案中，所述重组载体还包含编码Furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ACE2蛋白信号肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述Furin蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。在某些实施方案中，所述ACE2蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。在另一方面，本专利技术提供了一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含有ACE2蛋白和/或Furin蛋白。在某些实施方案中，所述类病毒颗粒由如前所述的重组载体与核酸组分共转染哺乳动物细胞而包装得到。在本专利技术中，如前所述的重组载体自组装形成了所述类病毒颗粒的外壳。在某些实施方案中，所述类病毒颗粒还含有核酸组分。此类核酸组分例如被包裹在如前所述的重组载体自组装形成的外壳内。在某些实施方案中，所述核酸组分选自下述的任意一项或多项：(a)外源DNA，或者编码外源蛋白或多肽的外源DNA，或者编码RNA的外源DNA；(b)一种载体，其任选地包含(a)中所述的外源DNA；(c)外源RNA，或者编码外源蛋白或多肽的外源RNA；(d)一种载体，其任选地包含(c)中所述的外源RNA。在某些实施方案中，所述核酸组分为包装质粒。在另一方面，本专利技术提供了一种细胞株，所述细胞表达或过表达ACE2蛋白和Furin蛋白。在某些实施方案中，所述细胞株由如前所述的类病毒颗粒转染哺乳动物细胞而得到。在某些实施方案中，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。在某些实施方案中，所述细胞为293T细胞。在某些实施方案中，所述细胞株的基因组中整合有编码ACE2蛋白和Furin蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述ACE2蛋白和Furin蛋白为天然人ACE2蛋白和天然人Furin蛋白。在某些实施方案中，所述ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。在某些实施方案中，所述Furin蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在某些实施方案中，所述细胞株的基因组中还整合有编码Furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ACE2蛋白信号肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述Furin蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。在某些实施方案中，所述ACE2蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。在某些实施方案中，所述细胞株的保藏号编号为CCTCCNo:C202189。在另一方面，本专利技术提供了一种制备如前所述的细胞株的方法，所述方法包括：(1)将编码ACE2蛋白的第一核酸组分和编码Furin蛋白的第二核酸组分共转染哺乳动物细胞；任选地，将第三核酸组分与所述第一核酸组分和第二核酸组分共转染哺乳动物细胞，获得类病毒颗粒；(2)将所述类病毒颗粒转染哺乳动物细胞；(3)筛选步骤(2)获得的细胞，获得的阳性细胞即为所述细胞株。在某些实施方案中，在步骤(1)中，所述第三核酸组分含有类病毒颗粒所需的一个或多个基因或元件。在某些实施方案中，所述一个或多个基因或元件包含gag基因、env基因和/或pol基因。在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过抗生素或荧光标记筛选所述培养获得的细胞。在某些实施方案中，所述抗生素为潮霉素或杀稻瘟菌素。在某些实施方案中，所述第一核酸组分和第二核酸组分包含于相同的载体或不同的载体中。在某些实施方案中，所述第一核酸组分、第二核酸组分和第三核酸组分包含于相同的载体或不同的载体中。在另一方面，本专利技术提供了一种检测SARS-CoV-2类病毒感染力的方法，所述方法包括，将如前所述的细胞株与SARS-CoV-2类病毒接触，并测试病毒滴度。在某些实施方案中，所述方法包括，将如前3所述的细胞株与SARS-CoV-2类病毒接触并孵育，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组载体，其含有编码ACE2蛋白和Furin蛋白的核苷酸序列；/n优选地，所述ACE2蛋白和Furin蛋白为天然的哺乳动物(例如，人)的ACE2蛋白和Furin蛋白；/n更优选地，所述ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；更优选地，所述Furin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；/n优选地，所述重组载体为表达载体；/n更优选地，所述重组载体由质粒构建；进一步优选地，所述质粒选自pLV，pcDNA3.1+、pCAG3.1和pCMV3.1；/n优选地，所述重组载体还包含编码Furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ACE2蛋白信号肽的核苷酸序列；/n更优选地，所述Furin蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；更优选地，所述ACE2蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，其含有编码ACE2蛋白和Furin蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述ACE2蛋白和Furin蛋白为天然的哺乳动物(例如，人)的ACE2蛋白和Furin蛋白；
更优选地，所述ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；更优选地，所述Furin蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；
优选地，所述重组载体为表达载体；
更优选地，所述重组载体由质粒构建；进一步优选地，所述质粒选自pLV，pcDNA3.1+、pCAG3.1和pCMV3.1；
优选地，所述重组载体还包含编码Furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ACE2蛋白信号肽的核苷酸序列；
更优选地，所述Furin蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；更优选地，所述ACE2蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。


2.一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含有ACE2蛋白和Furin蛋白；
优选地，所述类病毒颗粒由权利要求1所述的重组载体与核酸组分共转染哺乳动物细胞而包装得到；
优选地，所述核酸组分选自下述的任意一项或多项：
(a)外源DNA，或者编码外源蛋白或多肽的外源DNA，或者编码RNA的外源DNA；
(b)一种载体，其任选地包含(a)中所述的外源DNA；
(c)外源RNA，或者编码外源蛋白或多肽的外源RNA；
(d)一种载体，其任选地包含(c)中所述的外源RNA；
优选地，所述核酸组分为包装质粒。


3.一种细胞株，所述细胞表达或过表达ACE2蛋白和Furin蛋白；
优选地，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；更优选地，所述细胞为293T细胞；
优选地，所述细胞株的基因组中整合有编码ACE2蛋白和Furin蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述ACE2蛋白和Furin蛋白为天然人ACE2蛋白和天然人Furin蛋白；
更优选地，所述ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；更优选地，所述Furin蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；
优选地，所述细胞株的基因组中还整合有编码Furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ACE2蛋白信号肽的核苷酸序列；
更优选地，所述Furin蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；更优选地，所述ACE2蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；
优选地，所述细胞株的保藏号编号为CCTCCNo:C202189。


4.一种制备权利要求3所述的细胞株的方法，所述方法包括：
(1)将编码ACE2蛋白的第一核酸组分和编码Furin蛋白的第二核酸组分共转染哺乳动物细胞；任选地，将第三核酸组分与所述第一核酸组分和第二核酸组分共转染哺乳动物细胞，获得类病毒颗粒；
(2)将所述类病毒颗粒转染哺乳动物细胞；
(3)筛选步骤(2)获得的细胞，获得的阳性细胞即为所述细胞株；
优选地，在步骤(1)中，所述第三核酸组分含有类病毒颗粒所需的一个或多个基因或元件；优选地，所述一个或多个基因或元件包含gag基因、env基因和/或pol基因；
优选地，在步骤(3)中，通过抗生素或荧光标记筛选所述培养获得的细胞；更优选地，所述抗生素为潮霉素或杀稻瘟菌素；
优选地，所述第一核酸组分和第二核酸组分包含于相同的载体或不同的载体中；
优选地，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佑春，黄维金，张黎，聂建辉，张悦，吴佳静，李倩倩，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11