本发明专利技术公开了一种增加Survivin表达的CAR‑T细胞并联合IL‑15在制备抗肿瘤药物中的应用，属于医学领域。具体公开一种核酸构建体，其结构为：car‑（2A）‑e，car表示嵌合抗原受体核苷酸序列，2A表示自剪切序列，e表示功能性融合蛋白编码序列，功能性融合蛋白的编码基因为Survivin基因，Survivin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术通过试验验证白细胞介素‑15通过PI3K/Akt途径调节Survivin基因的表达，从而调节CAR‑T细胞中TSCM细胞群的形成，以实现抗肿瘤作用，这为细胞存活和Tscm的产生提供了新的见解，并为其在过继细胞治疗中的快速应用奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
增加Survivin表达的CAR-T细胞并联合IL-15在制备抗肿瘤药物中的应用
本专利技术涉及医学领域，特别是涉及一种增加Survivin表达的CAR-T细胞并联合IL-15在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
白细胞介素-15（IL-15）与白细胞介素-2（IL-2）在细胞因子受体生物学上的相似性引起了人们的广泛关注。IL-15和IL-2是一类常见的细胞因子,参与T细胞分化和稳态的调节[1]。它们具有许多共同的生物学活性，可能是因为它们具有IL-2受体复合物的共同成分。共同的活性包括活化的T细胞和NK细胞的生长和迁移，以及诱导B细胞的增殖和分化[2]。IL-15和IL-2受体均为异三聚体复合物，该复合物由IL-2的β和γc亚基以及特异性的α亚基组成[1]。由于IL-2具有很强的扩增T细胞和刺激T细胞功能的能力，是最早用于临床癌症试验的细胞因子。然而，IL-2的较强毒性副作用限制了其应用。最近，因其IL-15低毒在临床上使用得到进一步加强，并且有报道过表达IL-15或给予rIL-15可以保护小鼠免受各种感染[3,4]。T细胞激活是适应性免疫应答的核心，而IL-15是所有这些检查点的主动控制器中的关键角色之一。IL-15促进原始和记忆性CD8+T细胞的存活[5]，并增强CD4+和CD8+T细胞的交叉启动以及TEM细胞和CD44hi或CD122hi记忆性CD8+T细胞的增殖[6]。在免疫反应的收缩期，IL-15通过KLRG1和CD127的表达调节T细胞亚群[7]。它通过抑制IL-2诱导的激活诱导的效应T细胞的细胞死亡来维持记忆T细胞反应，在体内给予rIL-15保护了大多数效应T细胞[8]。值得注意的是，在没有宿主影响时，IL-15的存在为长期维持记忆CD8+T细胞对特异Ag的记忆提供了信号[9]。而且，IL-15在攻击过程中重新激活记忆性CD8+T细胞，因此成为疫苗的一个有吸引力的选择[10]。通过改变CCR7和CD62L的表达，IL-15调节T细胞迁移，这是对抗感染的关键条件[11]。对于T细胞的发育、分化和激活机制，大量数据指出PI3K-Akt-mTOR通路是调节的关键[12]。活化的AKT磷酸化关键靶点，通过抑制Bcl-2家族促凋亡成员而促进细胞存活。mTOR是PI3K/Akt信号转导的重要下游效应子之一，它是一种丝氨酸/苏氨酸促进细胞存活和增殖的蛋白质翻译所需的蛋白激酶[13]。Survivin是PI3K/Akt信号通路的另一个下游靶点，是一种进化上保守的真核蛋白质，对细胞分裂至关重要，并通过拮抗半胱天冬酶活性发挥凋亡抑制剂的作用[14,15]。因此，它作为一个潜在的肿瘤治疗靶点受到了广泛的关注。此外，Survivin在发育过程中[16]和增殖的成体细胞中表达[17]，特别是激活的T淋巴细胞[18]和自我更新的干细胞中表达[19]。因此，Survivin是活跃增殖细胞的标志物。CAR是一种合成分子，通过特异性识别肿瘤细胞上表达的表面蛋白诱导T细胞产生以根除肿瘤，这些表面蛋白由连接到铰链、跨膜和细胞内信号结构域的细胞外肿瘤抗原结合结构域组成[20]。表达CAR-T细胞（CAR-Tcells）可以通过胞外结构域的单链可变片段（singlechainvariablefragment,scfv）直接识别肿瘤相关抗原,然后被胞内信号转导激活,释放多种细胞因子,如穿孔素、颗粒酶、干扰素y等,诱导肿瘤细胞凋亡[21,22]。然而，有大量临床前和临床证据表明，CAR-T细胞易衰竭和持久性差，这限制了免疫疗法的有效性[23]。而CAR-T细胞治疗是近年来发展迅速的一种过继免疫治疗技术。如何提高抗肿瘤免疫细胞的有效性和远期疗效，对于提高细胞免疫治疗的疗效至关重要。TSCM具有抗原特异性记忆、初始T细胞的干细胞样特征、体内长期存活等特点，具有潜在的临床应用价值。IL-15作为一种重要的免疫刺激因子，与IL-15受体结合后，可促进产生具有过继免疫细胞治疗潜能的记忆T细胞，并可配合CAR-T细胞的抗肿瘤作用，有效增强CAR-T细胞的肿瘤侵袭性和抗肿瘤作用的持久性。许多文献报道CAR-T细胞可通过IL-15信号转导形成记忆干细胞表型，从而形成长期持久性。但其具体作用机制尚未见报道。早期研究表明，一些经典的癌基因如Survivin和C-myc在调节CD8+记忆T细胞的形成中起着重要作用。Survivin基因的表达可受PI3K/Akt通路调控。基于文献研究和前人研究，研究IL-15对CAR-T细胞细胞存活的影响及其作用机制，对于利用IL-15进行细胞免疫治疗实现抗肿瘤作用以及相关药物筛选具有重要的现实意义。参考文献如下：1.Kennedy,M.K.andL.S.Park,Characterizationofinterleukin-15(IL-15)andtheIL-15receptorcomplex.JClinImmunol,1996.16(3):p.134-43.2.Giri,J.G.,etal.,UtilizationofthebetaandgammachainsoftheIL-2receptorbythenovelcytokineIL-15.Emboj,1994.13(12):p.2822-30.3.Yajima,T.,etal.,OverexpressionofIL-15invivoincreasesantigen-drivenmemoryCD8+Tcellsfollowingamicrobeexposure.JImmunol,2002.168(3):p.1198-203.4.Thompson,A.L.andH.F.Staats,Cytokines:thefutureofintranasalvaccineadjuvants.ClinDevImmunol,2011.2011:p.289597.5.Berard,M.,etal.,IL-15promotesthesurvivalofnaiveandmemoryphenotypeCD8+Tcells.JImmunol,2003.170(10):p.5018-26.6.Picker,L.J.,etal.,IL-15inducesCD4effectormemoryTcellproductionandtissueemigrationinnonhumanprimates.JClinInvest,2006.116(6):p.1514-24.7.Rubinstein,M.P.,etal.,IL-7andIL-15differentiallyregulateCD8+T-cellsubsetsduringcontractionoftheimmuneresponse.Blood,2008.112(9):p.3704-12.8.Marks-Konczalik,J.,etal.,IL-2-inducedactivation-inducedcelldeathisinhibitedinIL-15transgenicmice.Pro本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如下所示结构：car-（2A）-e，其中，car表示嵌合抗原受体编码多核苷酸序列，2A表示自剪切序列，e表示功能性融合蛋白编码序列，所述功能性融合蛋白的编码基因为Survivin基因，所述Survivin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如下所示结构：car-（2A）-e，其中，car表示嵌合抗原受体编码多核苷酸序列，2A表示自剪切序列，e表示功能性融合蛋白编码序列，所述功能性融合蛋白的编码基因为Survivin基因，所述Survivin基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
2.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域特异性靶向肿瘤抗原，所述肿瘤抗原为膜抗原CD19，所述自剪切序列为P2A，“-”表示连接相邻核苷酸的磷脂键或连接肽。
3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸构建体。
4.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求3所述的重组载体或者染色体中整合有外源的权利要求1或2所述的核酸构建体。
5.一种药物组合物，其特征在于，其包括药学上可接受的载体以及权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟晓松，张莹，
申请(专利权)人：卡瑞济北京生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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