CAR-T细胞及其在非小细胞肺癌治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及靶向uPAR的三代嵌合抗原受体、经工程化以表达本发明专利技术的嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、以及所述经工程化的免疫效应细胞在治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)中的用途。肺癌(NSCLC)中的用途。

【技术实现步骤摘要】
for Cancer Research.2014；20(4):972
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984)。
[0005]最近，Amor等[Amor,C.,et al.,Senolytic CAR T cells reverse senescence
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associated pathologies.Nature,2020.583(7814):p.127
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132]在对衰老模型的研究中提出，将靶向uPAR的二代CAR分子用作抗衰老药物，以清除体内因多种因素引起的衰老细胞。研究显示，在施用衰老诱导剂后，二代uPAR CAR T细胞表现出了对经诱导而出现老化标志物的肺癌肿瘤细胞的一定清除作用。然而，Amor等的研究也显示，该衰老诱导剂与二代CAR分子的组合在荷瘤小鼠模型中的体内应用，对动物总体生存期的延长作用十分有限，相对于对照小鼠30天死亡，接受uPAR CAR T细胞的小鼠在40天以内也均死亡。此外，衰老诱导剂的应用剂量，及其可能对正常人体细胞的生理过程的干扰，也为该组合策略在临床癌症治疗上的应用，提出了安全性和有效性方面的诸多问题。
[0006]据目前最新的研究，肺癌仍是全世界癌症相关死亡的最常见原因。超过200万人被诊断患有肺癌，每年有176万人死于这种疾病[Thai,A.A.,et al.,Lung cancer.Lancet,2021.398(10299):p.535
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554]。肺癌的5年生存率因分期和地区差异而从4％到17％不等，而且这种疾病仍然不能通过手术等常规治疗得到很好的治疗[Hirsch,F.R.,et al.,Lung cancer:current therapies and new targeted treatments.Lancet,2017.389(10066):p.299
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311]。因此，本领域持续需要开发新的肺癌治疗方法以改善患者的结局和预后。
[0007]专利技术概述
[0008]在深入的研究中，本专利技术人发现，uPAR在部分的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的癌组织中呈现为显著的阳性表达，并且发现uPAR的高表达水平与NSCLC患者的存活率低相关。在此基础上，本专利技术人构建了uPAR靶向性三代CAR分子；通过检测转导了该CAR分子的T细胞单独在体外对uPAR阳性NSCLC癌细胞的选择性细胞毒性、以及在皮下、转移性、浸润前NSCLC肺癌动物模型和PDX模型中的抗肿瘤作用，确认了本专利技术三代CAR分子的治疗效用。进一步，本专利技术人应用高通量RNA测序，揭示了本专利技术uPAR CAR
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T细胞在NSCLC肺癌治疗中的分子机制，并获得了可用于预测CAR
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T细胞治疗效率的一系列基因表达模式；进而提出了该三代CAR
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T细胞与PD
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1阻断剂的联合疗法，并在NSCLC的PDX模型中确认了疗效的提升。基于这些研究，本专利技术人由此建立本专利技术。
[0009]因此，在第一方面，本专利技术提供了靶向uPAR的第三代嵌合抗原受体(CAR)多肽,所述嵌合抗原受体多肽，从N端到C端，包含：
[0010](i)特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域；
[0011](ii)任选地，铰链区/间隔区；
[0012](iii)跨膜结构域；
[0013](iv)CD28共刺激结构域和4
‑
1BB共刺激结构域的组合；和
[0014](v)CD3ζ信号传导结构域,
[0015]优选地，所述uPAR胞外抗原结合结构域由SEQ ID NO:1的优化核苷酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列编码。
[0016]在一些实施方案中，所述特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域为抗体或抗体片段，尤其是scFv，
[0017]优选地，所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:3的VL氨基酸序列中的LCDR1
‑
3和SEQ ID NO:4的VH氨基酸序列中的HCDR1
‑
3(尤其是Kabat定义的CDR序列，或SEQ ID NOs:
13
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18中所示的LCDR1
‑
3和HCDR1
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3序列)，再优选地，包含SEQ ID NO:3或其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的VL和/或包含SEQ ID NO:4或其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的VH，更优选地，包含SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH，再优选地，所述抗原结合结构域为包含SEQ ID NO:2或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的抗uPAR scFv。
[0018]在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体多肽还包含位于胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区或间隔区。在一些实施方案中，所述铰链区/间隔区选自：来自IgG的铰链区或来自CD8α或CD28胞外区的间隔区，且优选是人CD8α间隔区或CD28间隔区。在另一些实施方案中，所述铰链区/间隔区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列、或与其相差不超过1
‑
5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。
[0019]在一些实施方案中，所述跨膜结构域选自：CD4,CD8，CD28和CD3ζ的跨膜结构域，且优选是人CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域。在另一些实施方案中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:7或22的氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列，或与其相差不超过1
‑
5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。
[0020]在一些实施方案中，所述CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列，或与其相差不超过1
‑
5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。
[0021]在一些实施方案中，所述4
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1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列，或与其相差不超过1
‑
5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。
[0022]在一些实施方案中，所述CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向uPAR的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述嵌合抗原受体多肽，从N端到C端，包含：(i)特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域；(ii)任选地，铰链区/间隔区；(iii)跨膜结构域；(iv)CD28共刺激结构域和4
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1BB共刺激结构域的组合；和(v)CD3ζ信号传导结构域，优选地，其中，所述特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域为抗体或抗体片段，尤其是scFv，再优选地，所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:3的VL氨基酸序列中的LCDR1
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3和SEQ ID NO:4的VH氨基酸序列中的HCDR1
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3(尤其是Kabat定义的CDR序列，或SEQ ID NOs:13
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18中所示的LCDR1
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3和HCDR1
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3序列)，再优选地，包含SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH，再优选地，所述抗原结合结构域为包含SEQ ID NO:2或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的scFv。2.权利要求1的CAR多肽，其中，所述铰链区/间隔区选自：来自IgG的铰链区或来自CD8α或CD28胞外区的间隔区，且优选是人CD8α间隔区或CD28间隔区，例如，包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的CD28间隔区；和/或其中，所述跨膜结构域选自：CD4,CD8，CD28和CD3ζ的跨膜结构域，且优选是人CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，或者，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:7或22所示的氨基酸序列。3.权利要求1
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2任一项的CAR多肽，其中，所述CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列；和/或其中，所述4
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1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。4.权利要求1
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3任一项的CAR多肽，其中，所述CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列；优选地，所述CAR多肽包含具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的胞质结构域。5.权利要求1
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4任一项的CAR多肽，其中，所述CAR多肽，从N端到C端，包含：(a)SEQ ID NO:2所示的抗uPAR scFv；(b)SEQ ID NO:6所示的CD28间隔区和SEQ ID NO:7所示的CD28跨膜结构域；(c)SEQ ID NO:11所示的CD28共刺激结构域和SEQ ID NO:10所示的4
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【专利技术属性】
技术研发人员：钟晓松，仝帅，
申请(专利权)人：卡瑞济北京生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：