一种靶向敲除HBx蛋白的质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种靶向敲除HBx蛋白的pCMVHBV‑HBx(‑)质粒以及质粒的构建方法，构建方法步骤以下：以pCMVHBV质粒为模板，设计HBx的CDS突变型引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶回收，孵育，大肠杆菌转化，测序验证得到pCMVHBV‑HBx(‑)质粒。本发明专利技术的pCMVHBV‑HBx(‑)质粒可以靶向敲除HBx蛋白，显著抑制pgRNA和cccDNA的形成。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向敲除HBx蛋白的质粒及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种靶向敲除HBx蛋白的质粒及其构建方法应用。
技术介绍
乙肝病毒(HBV)是一种肝嗜性小DNA病毒，其引起的慢性肝炎、肝纤维化和肝癌严重危害着人类的健康。全球约3.5亿人感染乙肝病毒，其中亚洲占约3/4。乙肝病毒核衣壳内的乙肝病毒基因组是含有不完全双链的DNA(rcDNA)，在病毒感染人肝细胞后，随着核衣壳脱去，rcDNA会入核并经由修补机制形成共价闭合环状的DNA(cccDNA)。cccDNA可经由宿主RNA聚合酶II转录出包括乙肝病毒病毒前基因组RNA(pgRNA)在内的多条长短不一的乙肝病毒RNA，病毒蛋白即以此些RNA作为模板进行翻译，其中pgRNA还可以作为模板通过逆转录生成rcDNA，进而包装入病毒核衣壳蛋白而进入新的一轮复制周期。正是由于cccDNA在乙肝病毒复制过程中作为DNA-RNA-DNA模板以及cccDNA和pgRNA很难彻底于肝内清除的特性，cccDNA在乙肝病毒感染慢性化、再发及治疗停止耐药中扮演重要角色。乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白(HBx)，是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质直接作用，从而调节基因表达及宿主细胞蛋白质功能，进而影响病毒的复制、宿主细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌变等。当前，用于治疗慢性乙型肝炎患者的药物主要有干扰素和核苷类似物，但这两种治疗存在耐药性以及副反应大等问题，且不能达到彻底清除病毒pgRNA和cccDNA这一理想的治疗目标，一旦停药，患者又有再次发病的风险，因此，探索特异性靶向敲除HBx蛋白，抑制pgRNA和cccDNA表达的质粒以及药物，具有非常重要的应用价值。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种特异性靶向敲除HBx蛋白，抑制pgRNA和cccDNA表达的质粒。第一，本专利技术提供了一种靶向敲除HBx蛋白的质粒，所述质粒为pCMVHBV-HBx(-)，所述质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。第二，本专利技术提供了一种靶向敲除HBx蛋白的质粒的构建方法，包括以下步骤：以pCMVHBV质粒为模板，加入HBx的CDS突变型引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶回收，孵育，大肠杆菌转化，测序验证得到pCMVHBV-HBx(-)质粒。在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物是由HBx的CDS区域编码第六位蛋白的碱基突变而成。在以上技术方案的基础上，优选的，所述HBx的CDS区域编码第六位蛋白的碱基突变是密码子TGC突变为终止密码子TGA。在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物包括一个正向引物和一个反向引物，其中：正向引物序列：5’-CTGTGATGCCAACTGGATCCTGCG-3’；反向引物序列：5’-GCATCACAGCCTAGCAGCCAT-3’。在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR扩增体系包括：正向引物、反向引物和pCMVHBV，其中正向引物、反向引物和pCMVHBV的体积比为正向引物:反向引物:pCMVHBV＝5:5:4；所述PCR反应程序为：98℃预变性30sec，98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，98℃预变性30sec，72℃彻底延伸3min，变性-退火-延伸程序重复循环25次。第三，本专利技术提供了一种靶向敲除HBx蛋白的质粒在制备治疗乙肝病毒药物中的应用。第四，本专利技术提供了一种靶向敲除HBx蛋白的质粒在制备pgRNA和cccDNA抑制剂中的应用。本专利技术的一种特异性靶向敲除HBx蛋白，抑制pgRNA和cccDNA表达的质粒相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术的pCMVHBV-HBx(-)质粒可以靶向敲除HBx蛋白，抑制病毒的复制、细胞的增殖与分化、细胞癌变。(2)HBx蛋白敲除后显著抑制了pgRNA和cccDNA的形成，可用于制备pgRNA和cccDNA抑制剂。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例三敲除HBx后肝癌细胞的cccDNASouthernBlot电泳图，图中A为pCMVHBV，B为pCMVHBV-HBx(-)，C为pCMVHBV-HBx(-)+HBx；图2为实施例三敲除HBx后肝癌细胞的cccDNA表达量；图3为实施例三敲除HBx后肝癌细胞的RNANorthernBlot电泳图，图中A为pCMVHBV，B为pCMVHBV-HBx(-)，C为pCMVHBV-HBx(-)+HBx；图4为实施例三敲除HBx后肝癌细胞的pgRNA(3.5kb)、HBs(2.1kb、2.4kb)RNA的表达量；图5为实施例三敲除HBx后肝癌细胞的HBx的RNA的表达量。具体实施方式下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。实施例一质粒构建以pCMVHBV质粒为模板，加入HBx的CDS突变型引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶回收，孵育，大肠杆菌转化，测序验证得到pCMVHBV-HBx(-)质粒，pCMVHBV-HBx(-)质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。1.设计引物引物是由HBx的CDS区域编码第六位蛋白的碱基突变而成，第六位蛋白的碱基密码子TGC突变为终止密码子TGA。HBx的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，PCR引物包括一个正向引物和一个反向引物。引物序列见表1：表1PCR引物引物核苷酸序列序列号正向引物CTGTGATGCCAACTGGATCCTGCGSEQIDNO:2反向引物GCATCACAGCCTAGCAGCCATSEQIDNO:32.扩增并回收目的核酸片段以pCMVHBV质粒为模板，pCMVHBV质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，加入上述引物配制反应体系，PCR体系如表2所示。将配置好的反应体系放入PCR仪进行PCR扩增得到目的核酸片段，PCR反应程序如表3所示。表2PCR体系表试剂体积Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix12.5μL10μM正向引物1.25μL...

【技术保护点】
1.一种靶向敲除HBx蛋白的质粒，其特征在于，所述质粒为pCMVHBV-HBx(-)，所述质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除HBx蛋白的质粒，其特征在于，所述质粒为pCMVHBV-HBx(-)，所述质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.如权利要求1所述的一种靶向敲除HBx蛋白的质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以pCMVHBV质粒为模板，加入HBx的CDS突变型引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶回收，孵育，大肠杆菌转化，测序验证得到pCMVHBV-HBx(-)质粒。


3.如权利要求2所述的一种靶向敲除HBx蛋白的质粒的构建方法，其特征在于，所述引物是由HBx的CDS区域编码第六位蛋白的碱基突变而成。


4.如权利要求2所述的一种靶向敲除HBx蛋白的质粒的构建方法，其特征在于，所述引物包括一个正向引物和一个反向引物，其中：
正向引物序列：5’-CTGTGATGCCAACTGGATC...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，王腊，孙丹丹，邓洋，丁士杰，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42