用于生成软骨组织的分离的中隔软骨外来体制造技术

本发明专利技术涉及通过从中隔软骨分离的细胞释放到培养基中的外来体产生的制剂生成软骨。本发明专利技术的目的是，因为它诱导软骨形成并且还抑制炎症反应，所以生成可用于治疗软骨组织缺陷例如骨关节炎或关节病的软骨。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生成软骨组织的分离的中隔软骨外来体
本专利技术涉及用于生成软骨并且通过从中隔软骨分离的细胞释放到培养基中的微泡产生的制剂。
技术介绍
软骨在一些器官中是一种表现出骨功能的柔性、坚硬和白色的组织。在大多数原始脊椎动物和在发达脊椎动物中，胚胎的骨骼由软骨组成。在一个完全成熟的人体中，鼻、喉和耳中有软骨部位。它也用作覆盖彼此面对的形成关节的骨表面的垫层。关节软骨可以各种方式被损坏和腐蚀。这导致被称为骨关节炎或关节病的退行性关节疾病[1]。骨关节炎是一种非炎性、慢性和退行性疾病，其特征在于逐渐发生的软骨破坏、骨赘形成和软骨下硬化，特别是在承重关节中。在这种也被称为退行性关节炎、骨关节炎或肥大性关节炎的疾病中，关节软骨会逐渐损耗[2]。与骨不同，软骨不需要为存活而与骨直接接触。当组织液到达软骨的纤维基质时，成软骨细胞被滋养，且与异质植入物不同，它们不必嵌入组织中。因此，它可容易地用在鼻嵴中和甚至在上皮下囊(subepithelialpocket)中。为此目的，可使用即用型软骨或者中隔软骨、甲软骨或肋软骨。由于其柔性结构，软骨可容易地成形并可用作鼻中的小缺陷和边缘不规则的支撑物和填充材料两者。所用的大多数软骨移植物为自体的。新鲜或储存的同源软骨和经辐照的异源软骨已被使用多年，但因为它们随时间推移被再吸收，所以它们的使用减少[3]。中隔软骨、无血管软骨和肋软骨被广泛用于头部和颈部区域的软组织缺陷中，和用来代替鼻再造过程。有关组织工程的研究已尝试通过将合适的细胞接种到合适的再吸收生物材料支架中，以在体外和体内形成软骨。此外，用于头部-颈部区域内的软组织置换的人中隔软骨的组织工程具有在不久的将来提供临床益处的潜力[4]。在软骨损耗中，组织的自愈能力非常有限。尽管发生有限的修复，但是所得到的组织为纤维软骨，其不具有与原始关节软骨相同的生物力学性质。因此，软骨组织工程的目标是所得到的人造软骨具有与正常的关节软骨相同的生物力学性质[5]。在进行的临床研究中，可见用于软骨修复的技术提供短期和中期结果。正在进行有关用于软骨修复的第二代组织工程解决方案的广泛研究。正在研究将允许关节镜下植入细胞并因此降低发病率的各种方法和新技术。当今可用的众多技术中没有一种能够一贯地再现正常的透明软骨，且最佳的长期治疗仍然为未知的[6]。生物力学测试已证明，组织工程化的软骨的生物力学性质与正常的中隔软骨的生物力学性质相容[4,7]。当前针对软骨缺陷的治疗方法包括外科干预(例如，微骨折、镶嵌成型，包括高级和模拟生物材料支架的组织工程)、细胞移植(干细胞或软骨细胞植入物)、靶向疗法和疾病修饰疗法(消炎药)[8]。目前技术水平下遇到的问题可列举如下：在软骨形成、组织工程、治疗研究和美容软骨移植、软骨形成和软骨填充中使用的材料针对身体和细胞发生的炎症和免疫反应限制了这些材料的使用；这些材料对软骨形成的活性不充足；在进行细胞疗法的研究中，细胞引起的后续并发症为未知的；从长期来看，治疗的短期效果不充足。编号为EP2551342的欧洲专利申请文件作为目前技术水平申请之一，公开了一种诱导人下鼻甲间充质基质细胞分化为软骨细胞、骨细胞、神经细胞或脂肪细胞的方法。所述专利技术的方法是一种用于分离和培养软骨细胞的方法。编号为EP3145514的欧洲专利申请文件作为目前技术水平申请之一，公开了一种用于骨、软骨、牙齿和牙周组织再生的制剂。通过给予在所述专利技术中开发的制剂，刺激骨和/或软骨生长以治疗骨折和软骨损伤。在为开发该专利技术而进行的实验研究中，在DMEM培养培养基中，于培养皿中培养从牙髓分离的干细胞。编号为EP1926507的欧洲专利申请文件作为目前技术水平申请之一，公开了一种用于修复软骨缺陷的植入物和一种用于制造所述植入物的方法。植入物包含包被有具有软骨形成潜力的自体细胞的天然软骨组织的植入物主体。通过从软骨活组织检查分离的软骨细胞开始的体外细胞增殖来产生这些细胞。编号为US2017296590的美国专利申请文件作为目前技术水平申请之一，公开了一种用于诱导软骨细胞分化或软骨组织再生的组合物。所述专利技术的组合物包含从分化为软骨细胞的干细胞衍生的外来体。在所述专利技术中，脂肪干细胞被分化为软骨细胞并且外来体从软骨细胞分离。
技术实现思路
本专利技术的目的是出于美容和治疗目的，从分离的中隔软骨外来体诱导软骨形成。本专利技术的另一个目的是，由于其抗炎性质而形成不会对身体和细胞生成免疫反应、炎症、毒性和刺激的软骨。本专利技术的进一步目的是，因为它诱导软骨形成并且还抑制炎症反应，所以从分离的中隔软骨外来体得到用于治疗软骨组织缺陷例如骨关节炎或关节病的软骨组织。具体实施方式在附图中说明了为实现本专利技术的目的而开发的“用于生成软骨组织的分离的中隔软骨外来体”，其中；图1.是使用MTS测试评估以不同浓度向干细胞给予从中隔细胞得到的外来体24、48和72小时对细胞生存力的作用的图示。图2.是通过向干细胞给予不同浓度的从中隔细胞得到的外来体和软骨分化培养基，来评估其对CD44(a)和SOX9(b)基因表达水平的作用的图示。图3.是通过向干细胞给予不同浓度的从中隔细胞得到的外来体，来评估所述外来体对细胞的凋亡作用的图示。(a1-仅给予从中隔细胞得到的外来体(100%)，a2-仅给予从中隔细胞得到的外来体(50%)，a3-仅给予从中隔细胞得到的外来体(25%)，a4-通过仅给予细胞培养基生长的细胞，b-图示a1、a2、a3、a4图3)。图4.光学显微镜下的中隔细胞外来体(a)、外来体/软骨分化培养基混合物(1:1)(b)、用软骨分化培养基处理10天的细胞的阿尔新蓝(AlcianBlue)染色的图像(c)和对照应用(d)。图5.显示了在本专利技术范围内，中隔细胞外来体对花粉(a)和螨(b)过敏原激活的白细胞的作用的图示(通过流式细胞术设备，使用作为表面标志物的抗体测量CD4T辅助淋巴细胞、CD8T细胞毒性淋巴细胞、CD19B淋巴细胞和CD56自然杀伤细胞的图)。图6.显示了在本专利技术范围内，中隔细胞外来体对IL2(a)和PHA(b)激活的白细胞的作用的图示(通过流式细胞术设备，使用作为表面标志物的抗体测量CD4T辅助淋巴细胞、CD8T细胞毒性淋巴细胞、CD19B淋巴细胞和CD56自然杀伤细胞的图)。本专利技术涉及开发通过用于生成软骨组织的微泡产生的制剂，所述微泡由从中隔软骨分离的细胞释放。在本专利技术的实施中，使用中隔软骨干细胞。观察到从软骨细胞得到的微泡对干细胞的软骨分化有影响。这些微泡的有效范围被确定为以体积计5-100%。微泡可利用dH2O、EtOH、细胞培养培养基、PBS、DMSO及其混合物的溶液溶解。这些外来体从软骨衍生的细胞中的分离为这些外来体提供形成软骨的能力，其同样并入了干细胞的炎症抑制性质。因此，已通过实验证明这些外来体增强软骨形成和抑制炎症两者的事实，并显示在图中。由于这些性质，这些外来体可用于治疗软骨损伤和免疫系统相关疾病。本专利技术的制剂相对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的中隔软骨外来体，所述分离的中隔软骨外来体由于干细胞对软骨分化为有效的事实而用于诱导软骨组织形成。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180919 TR 2018/134591.分离的中隔软骨外来体，所述分离的中隔软骨外来体由于干细胞对软骨分化为有效的事实而用于诱导软骨组织形成。


2.权利要求1的分离的中隔软骨外来体，当使用5-100%时，所述分离的中隔软骨外来体为有效的。


3.权利要求1的分离的中隔软骨外来体，所述分离的中隔软骨外来体可利用选自dH2O、EtOH、细胞培养培养基、PBS、DMSO及其混合物的溶液溶解。


4.权利要求1的分离的中隔软骨外来体，所述分离的中隔软骨外来体用于治疗软骨组织缺陷，例如骨关节炎、肋软骨关节炎症、Tietze综合征或关节病。


5.从权利要求1的分离的中隔软骨外来体生成软骨组织的方法，所述方法包括以下步骤：
-在细胞培养箱中的包含10%外来体耗尽的胎牛血清(Invi...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·撒辛，P·N·塔斯利，E·阿夫沙尔阿普迪克，H·阿普迪克，A·S·萨法克，
申请(专利权)人：耶迪特普大学，
类型：发明
国别省市：土耳其;TR