一种促进体细胞重编程的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进体细胞重编程的方法，即通过外源添加或内源调控的方法来提高体细胞中H

【技术实现步骤摘要】
一种促进体细胞重编程的方法
本专利技术属于体细胞重编程领域，具体涉及一种促进体细胞重编程的方法。
技术介绍
干细胞目前可以通过以下几种方式获得：1)从囊胚中分离。胚胎干细胞(Embryonicstemcells，ESCs)来源于胚胎发育囊胚时期的内细胞团，具有多能性，并且可以无限增殖，是研究自我更新、发育和疾病的有力工具。但胚胎干细胞的获取涉及伦理问题，并且在进行临床应用时存在免疫排斥问题。2)核移植。将体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中，可消除体细胞特征并有发育为完整个体的潜能。但该技术操作困难，并且也涉及到伦理问题。3)细胞融合。将体细胞和干细胞融合得到的杂交细胞可消除体细胞特征，获得多能细胞的生化和发育特性。可用于研究遗传互补和寻找使体细胞发生重编程的因子。但该方法得到的细胞不是正常染色体细胞，不能用于临床应用。4)转录因子诱导的体细胞重编程。重编程是指通过一定的手段使已经分化的细胞恢复到具有分化能力的干细胞的状态。体细胞中转入转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)使体细胞发生重编程从而诱导产生多能干细胞(Inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。该方法得到的细胞可来源于患者本身，因此在临床应用时不会发生免疫排斥，并且不涉及伦理问题。但在重编程过程中细胞的基因组整合了外源基因，临床应用有成瘤的风险。5)小分子诱导的体细胞重编程(化学重编程)。体细胞培养时加入小分子化合物，将体细胞诱导为多能干细胞。这种方法得到的干细胞可来源于患者本身的体细胞，排除免疫排斥和伦理问题；并且没有外源基因的插入，临床应用更加安全。但该方法目前效率低、耗时久并且分子机制尚不明确，限制了干细胞的临床应用。因此寻找新的小分子来提高重编程效率、揭示其中的机制，对iPSCs的临床应用非常有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种促进体细胞重编程的方法。本专利技术所采用的具体技术方案如下：本专利技术提供了一种促进体细胞重编程的方法，即通过外源添加或内源调控的方法来提高体细胞中H2S的生成，进而促进体细胞的重编程(记为方案A)。作为优选，所述体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(记为方案B)。作为方案A或B的优选，所述外源添加为化学诱导方法。进一步的，所述化学诱导方法如下：将基础培养基中添加N-乙酰-L-半胱氨酸，得到重编程培养基；利用重编程培养基培养重编程早期阶段的细胞；通过提高体细胞内H2S的产生，从而调控了线粒体氧化磷酸化活性和细胞内氧化还原稳态，最终促进了体细胞的重编程。更进一步的，所述重编程培养基中N-乙酰-L-半胱氨酸的浓度为5mM。更进一步的，所述N-乙酰-L-半胱氨酸的初始浓度为1M，N-乙酰-L-半胱氨酸与基础培养基的混合比例为1:200。其中，第一种化学诱导方法的步骤具体如下：1)在MEF培养基中接种待重编程的体细胞；2)在MEF培养基中培养体细胞1天后，将MEF培养基更换为第一重编程培养基；所述第一重编程培养基为添加了NAC的Stage1培养基；所述Stage1培养基包括78％DMEM，10％KSR，10％FBS，1％NEAA，1％P/S，0.055mMβ-ME，20ng/mLbFGF，0.5mMVPA，20μMCHIR99021，10μM616452，5μMParnate，50μMForskolin，0.5μMAM580，5μMEPZ004777和250μMvitaminC；3)每4天更换一次新的所述第一重编程培养基，连续培养12天；4)在体细胞培养重编程的第12天，将所述第一重编程培养基更换为Stage2培养基；所述Stage2培养基包含78％DMEM，10％KSR，10％FBS，1％NEAA，1％P/S，0.055mMβ-ME，20ng/mLbFGF，0.5mMVPA，10μMCHIR99021，10μM616452，5μMParnate，10μMForskolin，0.5μMAM580，0.05μMDZNep，0.5μM5-aza-dC，5μMSGC0946和250μMVc；5)每4天更换一次新的所述Stage2培养基，连续培养12天；6)在体细胞培养重编程的第24天，将所述Stage2培养更换为Stage3培养基；所述Stage3培养基包括47％DMEM/F12，47％Neurobasal培养基，1×N2supplement，1×B27supplement，1％NEAA，1％P/S，0.055mMβ-ME，1,000U/mLLIF，3μMCHIR99021和0.2μMPD0325901；7)每4天更换一次新的所述Stage3培养基，连续培养12～16天，完成体细胞的重编程培养过程。第二种化学诱导方法的步骤具体如下：1)将待重编程的体细胞进行慢病毒转染，所述慢病毒表达Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc基因；2)将转染后的体细胞传代培养；3)将传代培养后的体细胞置于第二重编程培养基中，每4天更换一次新的所述第二重编程培养基，连续培养8天，完成体细胞的重编程培养过程；所述第二重编程培养基为添加了NAC的初始培养基；所述初始培养基包括78％DMEM，10％KSR，10％FBS，1％NEAA，1％P/S，0.055mMβ-ME和1,000U/mLmLIF，2μg/mL强力霉素。作为第一种化学诱导方法和第二种化学诱导方法的优选，所述第一重编程培养基和第二重编程培养基中，NAC的浓度均为5mM。作为方案A或B的优选，所述内源调控为基因过表达方法。进一步的，所述基因过表达方法如下：将待重编程的体细胞转染基因过表达病毒，使体细胞过表达Cbs基因；通过提高体细胞内H2S的产生，从而调控了线粒体氧化磷酸化活性和细胞内氧化还原稳态，最终促进了体细胞的重编程。其中，基因过表达方法的步骤具体如下：1)将Cbs基因的CDS片段从cDNA文库中进行扩增，然后和过表达载体大片段进行连接，得到过表达质粒；2)将所述过表达质粒包装成基因过表达病毒；3)将待重编程的体细胞加入带有培养基的培养板中，在重编程的第二天去掉培养板中的培养基，并向培养板中加入包装好的病毒，4小时后更换成新鲜的培养基，使体细胞的Cbs基因开始过表达；4)在体细胞重编程的第12天，对细胞进行Sall4免疫荧光染色，并对克隆进行计数来计算重编程效率。本专利技术相对于现有技术而言，具有以下有益效果：1)本专利技术的方法可以显著提高体细胞重编程的效率，促进诱导多能干细胞(iPSCs)的应用。2)本专利技术的方法能够增加细胞内H2S水平，通过体细胞内积累的H2S，能够调控了线粒体氧化磷酸化活性和细胞内氧化还原稳态，最终促进了体细胞重编程。附图说明图1为HA和NAC对H2S产生的作用效果对比图，其中，HA：250μM，NAC：5mM，DPBS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进体细胞重编程的方法，其特征在于，通过外源添加或内源调控的方法来提高体细胞中H

【技术特征摘要】
1.一种促进体细胞重编程的方法，其特征在于，通过外源添加或内源调控的方法来提高体细胞中H2S的生成，进而促进体细胞的重编程。


2.根据权利要求1所述的一种促进体细胞重编程的方法，其特征在于，所述体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。


3.根据权利要求1或2所述的一种促进体细胞重编程的方法，其特征在于，所述外源添加为化学诱导方法。


4.根据权利要求3所述的一种促进体细胞重编程的方法，其特征在于，所述化学诱导方法如下：
将基础培养基中添加N-乙酰-L-半胱氨酸，得到重编程培养基；利用重编程培养基培养重编程早期阶段的体细胞；通过提高体细胞内H2S的产生，从而调控了线粒体氧化磷酸化活性和细胞内氧化还原稳态，最终促进了体细胞的重编程。


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【专利技术属性】
技术研发人员：祝赛勇，王卫云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33