氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用技术

本发明专利技术公开了一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用，属于人多能干细胞向心肌细胞分化调控技术领域，其包括以下步骤：于含有分化第3‑5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂以诱导干细胞向心肌方向分化。该方法的特点是采用氯离子阻断剂来诱导干细胞向心肌方向分化。本申请详细阐述了该方法的具体操作步骤，并对分化的心肌细胞进行了鉴定和功能分析，为人多能干细胞来源的心肌细胞的产生提供了新思路。

【技术实现步骤摘要】
氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用
本专利技术涉及人多能干细胞向心肌细胞分化调控
，具体而言，涉及一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用。
技术介绍
人类多能干细胞(hPSCs)可以分化为我们体内的所有细胞类型，是研究人类胚胎发育的重要模型系统。通过hPSC分化产生的特定细胞类型在药物筛选研究中有极大的作用，可为药物筛选提供材料。但目前并没有有关氯离子通道阻断剂对心肌分化影响的相关报道。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法以解决上述技术问题。本专利技术的目的之二在于提供一种经上述方法得到的心肌细胞。本专利技术的目的之三在于提供一种原料含有上述心肌细胞的药物。本申请可这样实现：第一方面，本申请提供一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法，包括以下步骤：于含有分化第3-5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂以诱导干细胞向心肌方向分化。在可选的实施方式中，干细胞为人多能干细胞。在可选的实施方式中，人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞中的至少一种。在可选的实施方式中，氯离子通道阻断剂包括DIDS、DCEBIO和Ivermectin中的至少一种。在可选的实施方式中，DIDS的添加浓度为1-5μmol/L。在可选的实施方式中，DCEBIO的添加浓度为2-20μmol/L。在可选的实施方式中，Ivermectin的添加浓度为1-5μmol/L。在可选的实施方式中，氯离子通道阻断剂的处理时间为3-5天。在可选的实施方式中，分化培养基的成分包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、钠硒、转铁蛋白、脂质浓缩物及青链霉素。在可选的实施方式中，还包括在干细胞分化的第1天向含有干细胞的分化培养基中加入WNT通路激活剂以诱导干细胞向中胚层分化。在可选的实施方式中，WNT通路激活剂为GSK3β抑制剂，优选为CHIR99021。在可选的实施方式中，干细胞向中胚层分化后，去除WNT通路激活剂1天后，再加入氯离子通道阻断剂。在可选的实施方式中，还包括在氯离子通道阻断剂处理结束后使用含有胰岛素的分化培养基进行培养。在可选的实施方式中，分化培养基中胰岛素的浓度为5-20μg/mL。第二方面，本申请提供一种心肌细胞，其经上述方法分化培养得到。第三方面，本申请提供一种药物，其原料含有上述心肌细胞。本申请的有益效果包括：本申请采用成分清晰的方法诱导hPSC分化成心肌细胞，其中所采用试剂不包含动物来源成分，开创性的利用氯离子通道阻断剂诱导hPSC向心肌方向分化，发现其在干细胞分化中的新应用。此外该方法得到的心肌细胞表达成熟心肌细胞的标志物，具有人心房肌和心室肌的电生理信号，表明采用本申请提供的方法可得到具有功能的心肌细胞，可用于相关药物筛选。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1至图2为氯离子通道阻断剂对人胚胎干细胞H1向心肌方向分化的影响图；图3至图7为氯离子通道阻断剂DIDS诱导H1细胞向心肌细胞方向分化图；图8至图11为DIDS诱导hPSCH9细胞和iPSCNL4向心肌方向分化图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本申请提供的氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用进行具体说明。氯离子通道在真核、原核生物细胞上广泛分布，它介导的氯离子运输通常被认为是转运阴离子的主要途径。氯离子通道在细胞的生理与病理过程中起着重要的作用，如调节细胞增殖、转移、膜电位、pH值、凋亡等，且参与了多种心血管疾病，如心肌缺血、心律失常、心肌肥厚、心力衰竭等。专利技术人发现，氯离子通道阻断剂还可保护心肌细胞免受各种刺激引起的凋亡。本专利技术基于人多能干细胞向心肌方向分化的模型，研究了氯离子通道阻断剂在其中的作用，并开发了全新的心肌细胞分化方法。具体的，本申请提出一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法，包括以下步骤：于含有分化第3-5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂以诱导干细胞向心肌方向分化。上述干细胞为人多能干细胞。在可选的实施方式中，人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞中的至少一种，也即其可以仅是人胚胎干细胞，也可以仅是人诱导多能干细胞，还可以同时以人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞进行分化培养。在可选的实施方式中，还包括在干细胞分化的第1天向含有干细胞的分化培养基中加入WNT通路激活剂以诱导干细胞向中胚层分化。可参照地，WNT通路激活剂为GSK3β抑制剂，例如CHIR99021。可参照地，分化培养基的成分包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、钠硒、转铁蛋白、脂质浓缩物(ChemicallyDefinedLipidConcentrate)及青链霉素。在可选的实施方式中，分化培养基为E5分化培养基(该培养基可理解为E8培养基去除TGFβ，FGF2和胰岛素，并加入ChemicallyDefinedLipidConcentrate。具体的，E5分化培养基中含有DMEM/F12，全转铁蛋白(holo-transferrin)10μg/mL，亚硒酸钠(sodiumselenite)14ng/mL，抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐(L-Ascorbicacid2-phosphatesesquimagnesiumsalthydrate)64μg/mL以及脂质浓缩物(chemicallydefinedlipidconcentrate)，其中，脂质浓缩物以1：100的浓度进行稀释使用。此外，本申请所涉及的E8培养基可参照本领域常用的相关培养基，各成分的含量在此不做赘述。在可选的实施方式中，干细胞向中胚层分化后，去除WNT通路激活剂1天后，再加入氯离子通道阻断剂。在可选的实施方式中，氯离子通道阻断剂包括DIDS、DCEBIO和Ivermectin中的至少一种。可参照地，DIDS的添加浓度(也可理解为处理浓度，下同)可以为1-5μmol/L(该单位简称μM)，如1μM、2μM、3μM、4μM或5μM等。DCEBIO的添加浓度可以为2-20μM，如2μM、2.5μM、5μM、10μM或20μM等。Ivermectin的添加浓度可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n于含有分化第3-5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂以诱导所述干细胞向心肌方向分化。/n

【技术特征摘要】
1.一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
于含有分化第3-5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂以诱导所述干细胞向心肌方向分化。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为人多能干细胞；
优选地，所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氯离子通道阻断剂包括DIDS、DCEBIO和Ivermectin中的至少一种；
优选地，所述DIDS的添加浓度为1-5μmol/L；
优选地，所述DCEBIO的添加浓度为2-20μmol/L；
优选地，所述Ivermectin的添加浓度为1-5μmol/L。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氯离子通道阻断剂的处理时间为3-5天。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化培养基的成分包括DM...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国凯，孟雅，
申请(专利权)人：澳门大学，
类型：发明
国别省市：澳门;82