一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法技术

本发明专利技术公开了一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，通过qRT‑PCR评估lncRNATUG1，miR‑497和心肌细胞增强因子2CmRNA的水平，进行蛋白质印迹测定以确定MEF2C蛋白的表达，TUG1，miR‑497和MEF2C之间的内源性相互作用已通过双荧光素酶报告基因和RNA免疫沉淀实验得以证实。MiR‑497的过表达介导了TUG1敲低在AngII诱导的心肌肥大中的保护作用。另外，TUG1通过使miR‑497海绵化来调节MEF2C表达。TUG1的敲低至少部分通过靶向miR497/MEF2C轴挽救了AngII诱导的心肌肥大，突出了心肌肥大治疗的一种新的有希望的治疗靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法
本专利技术涉及基因编码
，特别涉及一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法。
技术介绍
心脏肥大是心脏对多种应激物的常见生理补偿反应，以维持正常的心脏功能。然而，由于心肌损伤，高血压应激或过度的神经体液活化而导致的心脏增大与适应不良重塑和心脏功能障碍有关，被分类为病理性肥大。病理性心脏肥大是二肌病，心力衰竭和心源性猝死的主要危险因素。尽管对心脏肥大中病理性调节剂的理解有所改善，但心脏肥大的分子机制仍不清楚。长非编码RNA(lncRNA)是200多个核苷酸的RNA分子，在一系列重要的生物学过程中发挥各种功能。已经发现它们与人类疾病有关，包括心脏肥大。例如，Wang等。报道说，心肌肥大相关因子(CHRF)通过充当microRNA(miRNA)-489的海绵来调节心脏肥大。Wang及其同事发现，与心脏肥大相关的表观遗传调节物(Chaer)是心脏肥大的表观遗传检查点。最近的文献表明，牛磺酸上调基因1(TUG1)通过使miRNA-29b-3p海绵化而参与了心肌肥大的发病机制。已知miRNA是一类内源的，小的非编码RNA，具有个核苷酸，在RNA诱导的沉默复合体(RISC)中存在，它们使基因表达沉默。现在发现miRNA的失调与人类疾病(包括心脏肥大)有关。通过抑制TGFβ途径，miR-15家族的成员MiR-497被鉴定为心脏肥大和纤维化的新型调节剂。最近的文献表明，通过靶向沉默调节蛋白4(Sirt4)，miR-497表达的增加在体外和体内改善了心脏肥大。先前的研究报道，TUG1通过海绵状miRNA通过竞争性内源RNA(ceRNA)网络在人类疾病中发挥调节功能。但是，TUG1和miR-497之间相互作用在心脏肥大中的作用仍然不确定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，通过靶向miR-497/肌细胞增强因子2C(MEF2C)轴，TUG1敲低可减轻体外的心肌肥大，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，包括如下实验步骤：步骤1：将所有大鼠保持在恒定温度(22±2℃)，60％湿度和12小时的明暗循环中，并在实验前至少喂食一种标准的日常饮食；步骤2：将动物模型实验大鼠分为两组，分为假手术组(n＝8)及横腹腹主动脉缩窄(TAC)组(n＝8)；步骤3：原代心肌细胞的分离，培养和治疗，从1-3天大的新生SD大鼠的心脏中分离原代心肌细胞；步骤4：细胞转染为了进行TUG1敲低研究，将心肌细胞与靶向TUG1的siRNA或非目标siRNA瞬时引入；步骤5：实时定量PCR(qRT-PCR)根据制造商的说明，使用RNA纯化试剂盒从心脏组织和心肌细胞中提取总RNA；步骤6：Westernblot在含冰的RIPA缓冲液(150mMTris-HCl，pH＝7.6，150mMNaCl，0.5％TritonX-100，0.1％SDS，1mM苯基甲烷磺酰氟，1mMNa3VO4)中制备总蛋白蛋白酶抑制剂混合物，然后使用BCA蛋白测定试剂盒进行定量；步骤7：生物信息学分析和双荧光素酶报告基因测定在线数据库LncBasePredictedv.2帮助识别可能与TUG1结合的miRNA；步骤8：RNA免疫沉淀(RIP)测定使用MagnaRIPRNA免疫沉淀试剂盒(Millipore)和抗Argonaute2(anti-Ago2，Abcam)抗体进行RIP测定；步骤9：统计分析所有数据均使用GraphPadPrism5.0软件进行分析，并表示为均值±标准差(SD)。进一步地，步骤1的大鼠饲养在无致病菌的动物饲养设施中。进一步地，步骤2假手术组(n＝8)，大鼠不经结扎暴露于腹主动脉，横腹腹主动脉缩窄(TAC)组(n＝8)，将大鼠腹主动脉暴露并结扎。进一步地，步骤2的TAC大鼠模型的构建步骤为：在大鼠腹部左侧开一个的纵向切口，然后，使用4-0缝线通过12号针将腹主动脉绕成两个圈，然后将针去除，术后8周，使用多普勒超声心动图对心脏的大小和功能进行分析，包括：左心室舒张末期大小(LVEDD)，左心室舒张末期收缩期直径(LVESD)，左室舒张末期压力(LVESP)，左室舒张末期压力(LVEDP)和缩短分数(FS)，随后，对所有大鼠实施安乐死，并确定心脏重量与体重的比率，并收集心脏组织以进行进一步评估。进一步地，步骤3对新生大鼠实施安乐死并立即切除心脏并切碎，在37℃下用0.1％II型胶原酶和0.1％胰蛋白酶(Gibco)消化心脏组织，离心后，收集心肌细胞并保存在补充有10％胎牛血清(FBS，Gibco)，1％青霉素/链霉素(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12(DMEM/F-12，Gibco)中，37℃和5％CO2的培养箱。进一步地，步骤4对于miR-497过表达，用成熟的miR-497模拟物(GenePharma)或加扰的寡核苷酸序列(miR-NC模拟物，GenePharma)转染心肌细胞，使用miR-497抑制剂(in-miR-497，GenePharma)进行MiR-497沉默，并将in-miR-NC(GenePharma)用作阴性对照。进一步地，步骤5的RNA提取物的质量和数量通过NanoDropND-2000分光光度计进行评估。进一步地，步骤6使用以下一级抗体：抗ANP(Abcam，英国剑桥；稀释度1：1000)，抗BNP(Abcam；稀释度1：500)，抗β-MHC(Abcam；稀释度1：1000)，抗-MEF2C(Abcam；稀释度1：1000)和抗β-肌动蛋白(Abcam；稀释度1：3000)，辣根过氧化物酶偶联的抗兔(Abcam；稀释度1：5000)或抗小鼠(Abcam；稀释度1：5000)IgG被用作二抗。进一步地，步骤7使用microT-CDS软件对miR-497分子靶标进行了生物信息学分析。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的数据支持TAC1在TAC大鼠模型和血管紧张素II(AngII)诱导的心肌细胞中上调。此外，通过靶向miR-497/肌细胞增强因子2C(MEF2C)轴，TUG1敲低可减轻体外的心肌肥大。具体实施方式下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，包括如下实验步骤：步骤1：动物的护理与使用所有动物实验程序均按照《农业实验动物的护理与使用指南》进行，雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠(8周大，)，饲养在无致病菌的动物饲养设施中，将所有大鼠保持在恒定温度(22±2℃)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，其特征在于，包括如下实验步骤：/n步骤1：将所有大鼠保持在恒定温度(22±2℃)，60％湿度和12小时的明暗循环中，并在实验前至少喂食一种标准的日常饮食；/n步骤2：将动物模型实验大鼠分为两组，分为假手术组(n＝8)及横腹腹主动脉缩窄(TAC)组(n＝8)；/n步骤3：原代心肌细胞的分离，培养和治疗，从1-3天大的新生SD大鼠的心脏中分离原代心肌细胞；/n步骤4：细胞转染为了进行TUG1敲低研究，将心肌细胞与靶向TUG1的siRNA或非目标siRNA瞬时引入；/n步骤5：实时定量PCR(qRT-PCR)根据制造商的说明，使用RNA纯化试剂盒从心脏组织和心肌细胞中提取总RNA；/n步骤6：Western blot在含冰的RIPA缓冲液(150mM Tris-HCl，pH＝7.6，150mM NaCl，0.5％Triton X-100，0.1％SDS，1mM苯基甲烷磺酰氟，1mM Na3VO4)中制备总蛋白蛋白酶抑制剂混合物，然后使用BCA蛋白测定试剂盒进行定量；/n步骤7：生物信息学分析和双荧光素酶报告基因测定在线数据库LncBasePredictedv.2帮助识别可能与TUG1结合的miRNA。/n...

【技术特征摘要】
1.一种长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，其特征在于，包括如下实验步骤：
步骤1：将所有大鼠保持在恒定温度(22±2℃)，60％湿度和12小时的明暗循环中，并在实验前至少喂食一种标准的日常饮食；
步骤2：将动物模型实验大鼠分为两组，分为假手术组(n＝8)及横腹腹主动脉缩窄(TAC)组(n＝8)；
步骤3：原代心肌细胞的分离，培养和治疗，从1-3天大的新生SD大鼠的心脏中分离原代心肌细胞；
步骤4：细胞转染为了进行TUG1敲低研究，将心肌细胞与靶向TUG1的siRNA或非目标siRNA瞬时引入；
步骤5：实时定量PCR(qRT-PCR)根据制造商的说明，使用RNA纯化试剂盒从心脏组织和心肌细胞中提取总RNA；
步骤6：Westernblot在含冰的RIPA缓冲液(150mMTris-HCl，pH＝7.6，150mMNaCl，0.5％TritonX-100，0.1％SDS，1mM苯基甲烷磺酰氟，1mMNa3VO4)中制备总蛋白蛋白酶抑制剂混合物，然后使用BCA蛋白测定试剂盒进行定量；
步骤7：生物信息学分析和双荧光素酶报告基因测定在线数据库LncBasePredictedv.2帮助识别可能与TUG1结合的miRNA。


2.如权利要求1所述的长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，其特征在于，步骤1的大鼠饲养在无致病菌的动物饲养设施中。


3.如权利要求1所述的长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，其特征在于，步骤2假手术组(n＝8)，大鼠不经结扎暴露于腹主动脉，横腹腹主动脉缩窄(TAC)组(n＝8)，将大鼠腹主动脉暴露并结扎。


4.如权利要求1所述的长非编码RNA上调基因在心肌肥大中的实验方法，其特征在于，步骤2的TAC大鼠模型的构建步骤为：在大鼠腹部左侧开一个的纵向切口，然后，使用4-0缝线通过12号针将腹主动脉绕成两个圈，然后将针去除，术后8周，使用多普勒超声心动图对心脏的大小和功能进行分析，包括：左心室舒张末期大小(LVEDD)，左心室舒张末期收缩期直径(LVESD)，左室舒张末期压力(LVESP)，左室舒张...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国荣，倪兴华，吴翔旻，邓欢，胡建新，周裔忠，
申请(专利权)人：张国荣，
类型：发明
国别省市：江西;36