一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法，肌细胞的提取：用手术刀切取肌组织，切成片状冲洗；放入培养皿中，然后切成柱状组织块，在切成0.5‑1mm

【技术实现步骤摘要】
一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法
本专利技术涉及外泌体
，具体是指一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法。
技术介绍
酒精性骨重构以全身骨质和骨量异常为特征，是酒精诱导骨组织细胞异常代谢而导致骨稳态失衡的综合反映，表现为骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞活性和功能异常，破坏了成骨/破骨生理平衡，是酒精性骨坏死、酒精性骨质疏松症等的共同病理过程。酒精性骨重构是酒精性骨病病理进程的核心，是阐释酒精对骨代谢影响的核心环节。酒精摄入对骨密度和骨量的影响与饮酒剂量、饮酒年限、饮酒频率以及其他危险因素等有关。长期大量饮酒可引起骨代谢紊乱、骨量丢失、骨微观结构改变致使骨生物力学性能异常。国际顶刊《自然》及《柳叶刀》最新研究表明，酒精摄入对机体造成诸多损害。酒精和乙醛(一种内源性和酒精衍生代谢产物)会破坏染色体结构导致干细胞基因组突变。在全球范围内，酒精使用是导致死亡的第七大风险因素，在15-49岁人群中，女性死亡率约3.8％和男性死亡率约12.2％可归因于酒精使用。长期酒精摄入可导致肝、肾、心、脑、骨和骨骼肌肉等诸多损伤，已是造成全球疾病负担的重要因素之一。外泌体(Exosome,exos)是指包含了复杂RNA(LncRNA,miRNA)和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，随后研究表明多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。人体内多种细胞均可分泌外泌体，包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，截止目前已经发现外泌体内含41860种蛋白质、2838种miRNA、3408种mRNA。W外泌体介导的细胞间通讯主要通过以下三种方式：一是外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路。二是在细胞外基质中，外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路。三是外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，非选择性的释放其所含的蛋白质、mRNA以及miRNA。越来越的研究证据表明，外泌体中包含的各种编码和非编码RNAs具有复杂的生物学功能，是外泌体包裹内容物作为细胞间信号传导的关键，其携带的mRNA可以进入细胞浆中，被翻译成效应蛋白发挥作用。不仅mRNA，外泌体内包裹的miRNAs、lncRNA、mtDNA、circRNA，同样可以转移至其它细胞中发挥生物学作用，尤其以miRNA在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平，参与细胞内多种基因表达水平的调节作用，对于效应细胞增殖、分化等发挥重要的调节作用。针对外泌体核酸内容物对股骨头坏死的治疗作用的研究也成为了热点，现有的实验证据证明外泌体在股骨头坏死中具有良好的治疗作用，其主要参与软骨修复、降低骨坏死、促进血管新生和骨形成、增加干细胞细胞增殖和分化等方面。外泌体中miRNAs亦可调节细胞自噬水平、抑制细胞凋亡、增强基质合成并降低体外分解代谢因子的表达来参与骨质代谢。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法，制备方法较为简单，制备的肌细胞外泌体对治疗酒精性骨重构效果较好。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法，包括以下步骤：步骤一：肌细胞的提取：(1)用手术刀切取肌组织，并切成片状进行冲洗；(2)将成片的肌组织平行放入培养皿中，然后切成柱状组织块，在切成0.5-1mm3小块，然后用D-PBSA浸洗组织块，静置后吸取上清液；(3)将浸洗后的组织块放入试管中，并向试管中添加蛋白酶，控制温度为35-40°，每间隔10-20min摇晃试管；(4)对试管中的组织块进行研磨，使得细胞从组织块上分离，然后静置5-10min，形成沉降的组织块和上清液；(5)将上清液通过尼龙网进行过滤，并过滤到离心管中，并加入生长培养液，培养24-48h；步骤二：用超速离心法分离获得肌细胞外泌体，并制成试剂，封装保存。外泌体试剂短时间内保存于4-6°，长时间需要保存于-70-90°。所述蛋白酶为链霉菌蛋白酶，且每1-3mg组织块用10-20ml链霉菌蛋白酶液，用链霉菌蛋白酶液消化组织块1-1.5h。尼龙网选用孔径为80-120um。所述试剂用于软骨修复、降低骨坏死、促进血管新生和骨形成、增加干细胞细胞增殖和分化方面。本专利技术与现有技术相比的优点在于：肌细胞的外泌体可以促进成骨细胞MC3T3-E1分化成骨细胞，可积极参与构建骨基质，对坏死骨组织具有修复作用，制成的试剂具有软骨修复、降低骨坏死、促进血管新生和骨形成、增加干细胞细胞增殖和分化方面的作用，对治疗酒精性骨重构效果较好，同时提取制备方法较为简单，容易实现。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术公开一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法，包括以下步骤：步骤一：肌细胞的提取：(6)用手术刀切取肌组织，并切成片状进行冲洗；(7)将成片的肌组织平行放入培养皿中，然后切成柱状组织块，在切成0.5-1mm3小块，然后用D-PBSA浸洗组织块，静置后吸取上清液；(8)将浸洗后的组织块放入试管中，并向试管中添加蛋白酶，控制温度为35-40°，每间隔10-20min摇晃试管；(9)对试管中的组织块进行研磨，使得细胞从组织块上分离，然后静置5-10min，形成沉降的组织块和上清液；(10)将上清液通过尼龙网进行过滤，并过滤到离心管中，并加入生长培养液，培养24-48h；步骤二：用超速离心法分离获得肌细胞外泌体，并制成试剂，封装保存。外泌体试剂短时间内保存于4-6°，长时间需要保存于-70-90°。所述蛋白酶为链霉菌蛋白酶，且每1-3mg组织块用10-20ml链霉菌蛋白酶液，用链霉菌蛋白酶液消化组织块1-1.5h。尼龙网选用孔径为80-120um。所述试剂用于软骨修复、降低骨坏死、促进血管新生和骨形成、增加干细胞细胞增殖和分化方面。肌细胞的外泌体可以促进成骨细胞MC3T3-E1分化成骨细胞，可积极参与构建骨基质，对坏死骨组织具有修复作用，制成的试剂具有软骨修复、降低骨坏死、促进血管新生和骨形成、增加干细胞细胞增殖和分化方面的作用，对治疗酒精性骨重构效果较好，同时提取制备方法较为简单，容易实现。以上公开的本专利技术优选实施例只是用于帮助阐述本专利技术。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该专利技术仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一：肌细胞的提取：/n(1)用手术刀切取肌组织，并切成片状进行冲洗；/n(2)将成片的肌组织平行放入培养皿中，然后切成柱状组织块，在切成0.5-1mm

【技术特征摘要】
1.一种治疗酒精性骨重构的外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：肌细胞的提取：
(1)用手术刀切取肌组织，并切成片状进行冲洗；
(2)将成片的肌组织平行放入培养皿中，然后切成柱状组织块，在切成0.5-1mm3小块，然后用D-PBSA浸洗组织块，静置后吸取上清液；
(3)将浸洗后的组织块放入试管中，并向试管中添加蛋白酶，控制温度为35-40°，每间隔10-20min摇晃试管；
(4)对试管中的组织块进行研磨，使得细胞从组织块上分离，然后静置5-10min，形成沉降的组织块和上清液；
(5)将上清液通过尼龙网进行过滤，并过滤到离心管中，并加入生长培养液，培养24-48h；
步骤二：用超速离心法分离获得肌细胞外泌体，并制成试剂，封装保存。

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：黑龙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23