间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法技术

本发明专利技术公开了一种间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法。本发明专利技术用平衡盐溶液间歇性饥饿处理1‑5小时/天并持续5‑15天，处理结束后换成心肌细胞培养基，检测相关成熟指标提高。发现平衡盐溶液间歇性饥饿处理心肌细胞，可诱导了心肌细胞形态结构，代谢和电生理上的成熟，操作简单，成本低。因此，这是一种创新性的诱导心肌成熟的方式，有助于解决心肌细胞成熟度低的问题，同时也可推动多能干细胞在心血管病中的临床应用。

【技术实现步骤摘要】
间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法。
技术介绍
心血管疾病已成为人类健康的头号杀手，最常见的疾病类型是心肌梗死，其主要特征是由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。由于成年心肌细胞的再生能力有限，原代人心肌细胞在体外难以获得和维持，心脏疾病研究和治疗面临瓶颈。人多能干细胞(PSC)主要包括胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)，其可在体外高效诱导分化为心肌细胞，且操作简单。在心脏病建模、药物发现和细胞治疗等方面显示出巨大潜力。但由于体外培养环境的不同和培养技术上的局限，PSC来源心肌细胞(PSC-CM)的生理状态无法像成体心肌细胞那样成熟，而更接近于胎儿心肌细胞状态。PSC-CM的不成熟特征阻碍了心血管疾病的研究进程和治疗效果。所以，提高PSC-CM的成熟度是亟待解决的问题。心肌细胞成熟的主要特征包括成熟性肥大、有组织性规律性肌原纤维排列、线粒体DNA拷贝数增加、氧化磷酸化能力增加、以及电生理和钙生理能力增强等。目前，用于提高PSC-CM成熟的方法包括长期培养法、组织工程、药物刺激和生物电刺激等。(1)长期培养心肌细胞。将PSC-CM连续体外培养了60天到1年，可使心肌细胞呈现出成熟心肌状态，如：心肌细胞伸长，细胞大小增加，肌节排列整齐等。但是长期培养很费时，成熟程度依然较低，稳定性差。(2)组织工程培养。随着组织工程在PSC-CM培养方案的改进，以基质胶或水凝胶等新型材料为介质，形成多种类型的心肌/心脏组织工程，如：心脏补片，3D心脏类器官等，可明显促进心肌细胞结构的成熟。但是，其特殊材料难以获得，操作技术难度大，对细胞生理状态影响较大。(3)电刺激来促进心肌细胞的成熟。最常用的就是通过电场刺激增强细胞排列和肌节结构。比如，在接近生理频率的电刺激PSC-CM，从1赫兹到6赫兹逐步增加刺激强度，使用一段时间后发现可改进心肌细胞成熟的多个方面，包括心肌细胞排列，肌节结构，钙处理能力和动作电位能力的增强。其局限性是对设备要求高，不适合大规模培养处理，需要花相当长的时间刺激和数据分析，并且下游分析难度高。可见这些方法对时间，成本和技术都有着较高的要求，难以推广。因此，迫切需要更有效的方法在可承受的时间和成本的前提下，推动PSC-CM的成熟。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术模拟生理状态下心肌成熟的过程，建立利用平衡盐溶液溶液间歇性饥饿提高PSC-CM成熟度的方法。其操作简单，成本低，成熟周期较短，且能够较全面的促进心肌成熟。本专利技术的第一个目的是提供了一种间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法，包括如下步骤：S1、获得纯化的心肌细胞，清洗去除表面培养液；S2、加入平衡盐溶液进行饥饿处理1～5小时，换回心肌细胞培养基培养19～23小时；S3、按照S1～S2步骤处理方法，连续处理5～15天进行间歇性饥饿；S4、间歇性饥饿后继续培养，获得成熟心肌细胞。进一步地，所述的心肌细胞为多能干细胞分化的心肌细胞或分离的原代心肌细胞或商业化的心肌细胞系。进一步地，商业化的心肌细胞系包括HL-1心肌细胞系或H9C2心肌细胞系。进一步地，在S1步骤中，清洗采用缓冲液进行清洗。进一步地，所述的缓冲液为Dulbecco's磷酸盐缓冲液(DPBS)、D-Hanks平衡盐溶液。进一步地，在S2步骤中，所述的平衡盐溶液为Earle's平衡盐溶液、Dulbecco's磷酸盐缓冲液或D-Hanks平衡盐溶液。进一步地，所述的心肌细胞培养基为CDM3培养基(RPIM-1640基础培养基加抗坏血酸，胎牛血清白蛋白和青霉素链霉素溶液)或商业化的心肌细胞培养基。进一步地，商业化的心肌细胞培养基为DMEM/F12培养基、CMM心肌培养基或CGM心肌细胞生长培养基。进一步地，在S4步骤中，间歇性饥饿后继续培养3～10天。进一步地，多能干细胞(PSC)包括胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)。所述的胚胎干细胞是一种源于囊胚内细胞团，经体外分离、培养获得的原始多能干细胞，具有分化机体内各种细胞的潜能并具有无限增殖和自我更新的特点。为排除伦理问题，本专利技术使用的是经伦理审查批准获得的人胚胎干细胞，包括商业化的人胚胎干细胞(如H1、H7、H9、ES3等)。所述的诱导多能干细胞是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞经过重编程技术获得具有分化潜能的干细胞。诱导性多能干细胞在形态、基因和蛋白表达以及分化能力等方面都与多能干细胞相似。本专利技术中使用的是可商购获得的诱导多能干细胞，或对体细胞重编程获得的诱导多能干细胞。特别指出，本专利技术所使用的人多能干细胞，无论人胚胎干细胞还是人诱导多能干细胞，均不能够发育成完整个体，且都是已通过伦理审查而建立的多能干细胞。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：在研究商业化人胚胎干细胞分化心肌细胞成熟的过程中，本专利技术通过在心肌细胞纯化后阶段，进行平衡盐溶液的饥饿处理，能模拟人出生时心肌的生理状态，促进心肌细胞的成熟。其实验周期较短，成本低，易操作，不仅能从形态结构上促进心肌成熟，还可以从代谢和电生理方面促使心肌达到一个更成熟的状态。因此这是一种创新性的促进心肌成熟的方法，解决心肌细胞成熟度低的问题，可推动多能干细胞在心血管疾病中的临床应用。与此同时，目前PSC-CM的成熟度较低，心脏移植这种幼稚的心肌细胞容易导致心率不齐，也不能很好地整合入心脏中，从而使治疗效果大打折扣。而本专利技术利用间歇性饥饿方法促进心肌细胞的成熟，有望解决这个问题，且利用饥饿处理后的心肌细胞线粒体的功能接近成体心肌细胞，氧化磷酸化能力增强。在饥饿这种相对恶劣环境的刺激下，心肌细胞抗恶劣环境的能力有可能比其他成熟方式来源的心肌细胞的抗压能力更强。所以移植入心肌梗塞的心脏中后，可能更有利于心肌细胞的存活，从而发挥作用，更有效的重塑和修复心脏结构功能。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细附图说明如后。附图说明图1为本专利技术中未进行饥饿处理的对照组和间歇性饥饿处理组的胚胎干细胞来源心肌细胞的免疫荧光照片(63倍油镜)，显示线粒体分布和肌节排列，以及对细胞面积和肌节长度的统计。图2为本专利技术中通过间歇性饥饿处理胚胎干细胞来源心肌细胞后，定量比较对照组和间歇性饥饿组细胞中成熟相关基因的表达。图3为本专利技术中未进行饥饿处理的对照组和间歇性饥饿处理组的胚胎干细胞来源心肌细胞中氧化磷酸化能量代谢的比较。图4为本专利技术中未进行饥饿处理的对照组和间歇性饥饿处理组的胚胎干细胞来源心肌细胞中电生理相关指标的比较。图5为本专利技术中未进行饥饿处理的对照组和间歇性饥饿处理组乳鼠心肌细胞的免疫荧光照片，以及对细胞面积和肌节长度的统计和比较。图6为本专利技术中乳鼠心肌细胞间歇性饥饿处本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、获得纯化的心肌细胞，清洗并去除表面培养液；/nS2、加入平衡盐溶液进行饥饿处理1～5小时，换回心肌细胞培养基培养19～23小时；/nS3、按照S1～S2步骤处理方法，连续处理5～15天进行间歇性饥饿；/nS4、间歇性饥饿后继续培养，获得成熟心肌细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、获得纯化的心肌细胞，清洗并去除表面培养液；
S2、加入平衡盐溶液进行饥饿处理1～5小时，换回心肌细胞培养基培养19～23小时；
S3、按照S1～S2步骤处理方法，连续处理5～15天进行间歇性饥饿；
S4、间歇性饥饿后继续培养，获得成熟心肌细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的心肌细胞为多能干细胞分化的心肌细胞或分离的原代心肌细胞或商业化的心肌细胞系。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的商业化的心肌细胞系包括HL-1心肌细胞系或H9C2心肌细胞系。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1步骤中，清洗采用缓冲液进行清洗。


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【专利技术属性】
技术研发人员：胡士军，雷伟，杨静思，于淼，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32