工程改造的细胞的产生及其用途制造技术

本公开涉及表达至少一种抗原衍生肽和至少一种免疫调节分子的遗传修饰的树突细胞或其前体，其医疗用途和制备方法。本发明专利技术还涉及产生生成IL‑10的CD49b

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程改造的细胞的产生及其用途
本公开涉及表达至少一种抗原衍生肽和至少一种免疫调节分子的遗传修饰的树突细胞或其前体，其医疗用途和制备方法。本专利技术还涉及产生生成IL-10的CD49b+LAG-3+Tr1细胞或抗原特异性FOXP3+T细胞的体外方式，以及相关医疗用途和药物组合物。
技术介绍
鉴定旨在选择性控制抗原(Ag)特异性致病T细胞反应和促进/恢复T-细胞介导的疾病中的耐受性的新型方法代表了管理人类中自身免疫疾病和器官移植的宏伟目标之一。与此一致，一种新型的疫苗接种(也称为“反向疫苗接种(inversevaccination)”或“致耐受性疫苗接种(tolerogenicvaccination)”)旨在诱导或恢复无反应情况的免疫状态，这可能是针对外来Ag(即蛋白质疗法、过敏原或转基因)抑或针对自体Ag(1)。致耐受性策略的总体目标是通过Ag特异性Teff细胞的删除/抑制/偏离来抑制不良反应，以及支持Ag特异性T调节性细胞(Treg)——叉头框P3(FOXP3)表达型Treg(FOXP3+Treg)(2)或生成IL-10的T调节性1型(Tr1)细胞(3)的诱导和/或扩增。人们已经提出了许多不同的反向疫苗接种方法：i).使用靶向不同细胞群(即抗CD3、抗CD20、抗CD52、CTLA-4Ig)的单克隆抗体或促炎性细胞因子(即抗TNFα，抗IL-1β)或者使用免疫调节化合物(即雷帕霉素(Rapamycin)，霉酚酸酯(MycophenolateMofetil))的非Ag特异性免疫疗法，ii).使用自体Ag或过敏原的Ag特异性免疫疗法。作为致耐受性策略的作用物，调节性细胞已被提议作为细胞治疗的工具。越来越多的证据表明树突细胞(DC)的不同子集，无论是自然产生的或者是实验诱导的，在维持组织稳态和促进耐受性中起到关键作用(参见(4-7))，从而作用为调节性细胞。DC的调节性能力取决于其未成熟状态，并且其可以通过免疫介导物、遗传操作或来自其他免疫细胞的信号诱导。致耐受性DC(tolDC)呈递Ag和初免Ag特异性T细胞，并且还可以诱导Ag特异性Treg(8)。更好的理解tolDC以及调节其诱导、活动和可塑性的机制的生物学以及开发适合于体外生成tolDC的方案为将其用途转化成免疫介导的疾病中的免疫疗法提供了可能性(8-12)。DC代表选择的致耐受性细胞满足促进/恢复Ag特异性耐受性的目标，因为它们i)促进Ag特异性Treg；ii)调节Ag特异性致病T细胞；iii)生成富含抗炎介导物的致耐受性微环境，其支持长期Ag特异性无反应情况的维持。到目前为止完成的原理论证性临床试验证明了基于tolDC的免疫治疗在自身免疫疾病中以及在器官移植后预防移植物排斥中的安全性和可行性(10、11、13-15)。然而，输注的DC的稳定性以及其至耐受性的维持对于改善成功的基于DC的细胞疗法的安全性和疗效仍然是待解决的问题。最佳tolDC应当在未激活的状态或者在抗炎细胞因子或抑制性分子丰富的微环境中呈递Ag。为了稳定这些条件，专利技术人提出了使用基于本领域先进的慢病毒载体(LV)技术的新型策略，其将确保生成稳定和有效的致耐受性DC。慢病毒载体(LV)将转导人DC前体(16)并诱导强而持久的抗肿瘤T细胞反应(17)。此外，LV介导的DC转导并不会在DC激活中导致重大改变(18)，这支持了LV介导的稳定且有效的Ag呈递以产生免疫原性或致耐受性DC的可能性。因此，到目前为止，LV已被用于遗传修饰DC，用于基于DC免疫原性的疗法。用编码肿瘤相关Ag的LV转导的DC产生肿瘤特异性CD8+T细胞(17)。只有在LV介导的Ag已及II类MHC呈递途径时，通过LV转导的DC对CD4+T进行初免才会发生。将编码与卵白蛋白(OVA)融合的不变链(invariantchain)(Ii)的LV(LV.IiOVA)体内注射转导的DC，所述转导的DC获得了在II类MHC的竞争中呈递编码的OVA并促进OVA特异性CD4+T细胞的能力(19)。将LV直接体内给予转导的DC提供一些优点：它不需要细胞操纵，并且载体本身触发急性炎症，这提供了佐剂效果；然而，它不能提供高特异性的细胞靶向。相反，体外LV介导的DC转导可以通过减少脱靶转导和通过转移的细胞的有限生命来显著改善安全性。此外，体外给予生成的LV转导的DC允许重复细胞给予。人们已经采用多种试剂来体外分化人tolDC(20)。为了定义用于体内的最佳致耐受性DC，最近报道了体外分化的tolDC的不同亚群的比较分析，该比较分析检测了它们的稳定性、细胞因子产生概况和抑制活性(20、21)。该结果表明，IL-10调节的成熟DC是用于基于致耐受性DC的疗法的最适合的细胞。专利技术人团队对鉴定IL-10作为促进有效致耐受性DC分化的关键因素做出了贡献，并且描述了命名为DC-10的细胞子集，其可以在IL-10存在的情况下由外周血单核细胞诱导，并且特征在于分泌大量IL-10的能力。DC-10是成熟骨髓细胞，其表达免疫调节分子，包括HLA-G、ILT3和ILT4，它们是体外Ag特异性Tr1细胞的有效诱导物(22、23)。DC-10是稳定的细胞，因为它们即使在激活(24)时仍保持其致耐受性活性。有趣的是，用自体DC-10刺激过敏原特异性T细胞促进了它们向生成IL-10的抑制性T细胞的转化(25)，这表明DC-10是将效应T细胞转化为Treg的良好候选物。体内转移后，tolDC中IL-10转化的鼠骨髓衍生的DC的过表达防止过敏性接触性皮炎(26)。赋予DC致耐受性的其他候选方案是诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(ID01)，色氨酸分解酶，在几种病理状态下的免疫调节剂。IDO的表达已通过抗原呈递细胞中的几种手段促进，包括纤维蛋白原和骨髓DC((27)，WO2013/040552、WO2018037108和WO2017192786)。总之，这些方法不能促进经处理的细胞中IDO的稳定且持久的过表达。临床医生的主要目标之一是寻找替代性治疗，以预防器官移植后的移植物排斥。改进在同种异体器官移植后用于防止排斥的免疫抑制疗法治疗显示了限制急性排斥的益处，然而，与长期免疫抑制方案相关联的副作用(参见下述批准的药物表1)代表了慢性移植失败的主要原因之一。标准免疫抑制方案是有效的。然而，它们需要长期治疗，而这些长期治疗与许多副作用相关联，并且相较于普通群体，目前移植患者的预期寿命，包括肾移植患者的预期寿命仍然明显较短(vanSandwijkMS等,NethJMed.2013)。每天给予免疫抑制治疗，会造成14,000美元的年成本。表1：批准的药物基于调节性细胞免疫疗法的替代疗法在最近十年进入临床领域，其目标是减少免疫抑制(28)。在它们中，基于T调节性细胞(Treg)的疗法。迄今为止，已经完成多达30个不同的临床试验，或者正在使用多克隆新分离的或体外扩增的Treg进行，以预防移植物排斥(29)。使用基于Treg的疗法正在进行的临床试验证明了该方法的安全性和一些临床益处。然而，几个未决问题仍待解决：-多克隆体外扩增的Treg介导体内泛免疫抑制(panim本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经核酸构建体修饰的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，所述构建体包含：/n-核酸序列a)，其编码嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由与至少一种抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段融合的人不变链组成，所述序列a)与第一启动子操作性地连接并且任选地与第一转录调节序列操作性地连接，和/n-核酸序列b)，其编码至少一种免疫调节蛋白，所述序列b)任选地操作性地连接第二启动子并且任选地操作性地连接第二转录调节序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180619 EP 18178595.71.一种经核酸构建体修饰的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，所述构建体包含：
-核酸序列a)，其编码嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由与至少一种抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段融合的人不变链组成，所述序列a)与第一启动子操作性地连接并且任选地与第一转录调节序列操作性地连接，和
-核酸序列b)，其编码至少一种免疫调节蛋白，所述序列b)任选地操作性地连接第二启动子并且任选地操作性地连接第二转录调节序列。


2.如权利要求1所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述序列a)在其3'端还包含至少一个miRNA靶序列。


3.如权利要求1或2所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述第一启动子和所述第二启动子是相同的或不同的。


4.如前述权利要求中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述核酸构建体还包含编码标志物的序列，优选编码选择性标志物的序列。


5.如前述权利要求中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述人不变链是lip33、lip41、lip35或lip43。


6.如前述权利要求中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段衍生自自体同源抗原和/或无害抗原和/或过敏原。


7.如前述权利要求中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段选自表2中所述的免疫显性肽的组。


8.如前述权利要求中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述免疫调节蛋白选自下组：IL-10，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，PDL-1，PDL-2，ILT-3，ILT-4，HO-1，ICOS-LGal9，HVME，HLA-G，HLA-E，IL-35，TGF-b，CTLA-4Ig，PGE2，TNFRs，Arg1，优选IL-10，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或其混合物。


9.如权利要求2-8中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述至少一个miRNA靶序列选自下组靶向：miR-15a，miR-16-1，miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-l，miR-21，miR-29a，miR-29b，miR-29c，miR-30b，miR-31，miR-34a，miR-92a-l，miR-106a，miR-125a，miR-125b，miR-126，miR-142-3p，miR-146a，miR-150，miR-155，miR-181a，miR-223和miR-424，优选miR155、miR146a或其混合物，优选所述miRNA靶序列是重复的。


10.如前述权利要求中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述细胞展现出下述特性中的至少一种：调节CD4+和CD8+T细胞反应；调节体外和/或体内抗原特异性CD4+和CD8+T细胞增殖；有利于生成调节性DC；有利于扩增抗原特异性Tr1和/或FOXP3+Treg细胞，具有致耐受性，在I类和II类MHC的情况下呈递抗原。


11.如前述权利要求中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述核酸构建体被插入载体，优选慢病毒载体，更优选单向或双向载体。


12.如前述权利要求中任一项所述遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，用于医疗用途。


13.如权利要求12所述的所述用途的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，用于预防和/或治疗选自下组的病症：移植物抗宿主病，器官排斥，自身免疫疾病，过敏性疾病，炎性或自身炎性疾病，基因疗法诱导的免疫反应。


14.如权利要求13所述的所述用途的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，其中，所述自身免疫疾病选自下组：1型糖尿病，自身免疫性肠病，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，多发性硬化，自身免疫性肌炎，牛皮癣，爱迪生氏病，格雷夫斯氏病，干燥综合征，桥本氏甲状腺炎，重症肌无力，血管炎，恶性贫血，乳糜泻，自身免疫性肝炎，斑秃，寻常型天疱疮，白癜风，再生障碍性贫血，自身免疫性葡萄膜炎，斑秃，肌萎缩性侧索硬化症(卢伽雷氏病)，强直性脊柱炎，抗GBM肾炎，抗磷脂综合征，骨关节炎，自身免疫性活动性慢性肝炎，自身免疫性内耳疾病(AIED)，巴洛病，白塞氏病，伯杰氏病，大疱性类天疱疮，心肌病，慢性疲劳免疫功能障碍综合征，查格-施特劳斯综合征，瘢痕性类天疱疮，冷凝集素病，结肠炎颅动脉炎，CREST综合征，克罗恩病，代戈氏病，皮肌炎和JDM，德维克疾病，湿疹，基本混合性冷球蛋白血症，嗜酸性筋膜炎，纤维肌痛–纤维肌炎，纤维化性牙槽炎，巨细胞动脉炎，肾小球肾炎，古德帕斯病，格林-巴利综合征，桥本氏甲状腺炎，肝炎，休斯综合征，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜，肠易激综合征，川崎病，扁平苔藓，狼疮状肝炎，狼疮/SLE，莱姆病，美尼尔氏病，混合性结缔组织病，肌炎：青少年肌炎(JM)，青少年皮肌炎(JDM)，和青少年多发性肌炎(JPM)，骨质疏松症，睫状体扁平部炎，寻常天疱疮，多腺自身免疫综合征，风湿性多肌痛，多发性肌炎，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，银屑病，雷诺氏综合征，瑞特氏综合征，风湿热，类风湿关节炎，巩膜炎，硬皮病，粘血综合征，斯蒂尔氏病，僵人综合征，西登哈姆氏舞蹈病，高安氏动脉炎，颞动脉炎，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，血管炎，...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·安农尼，S·A·格利高里，
申请(专利权)人：泰莱托恩基金会，圣拉斐尔基金会中心，圣拉斐尔医院有限公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT