获得肿瘤特异性T细胞受体的方法技术

本专利申请提供获得多种特异性识别来自个体的目标肿瘤抗原肽的T细胞受体的方法，该个体已在临床上受益于免疫疗法，诸如多抗原特异性细胞疗法。还提供肿瘤特异性TCR、表达此类TCR的经工程改造的免疫细胞、以及使用此类经工程改造的免疫细胞治疗疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】获得肿瘤特异性T细胞受体的方法相关专利申请的交叉引用本专利申请要求于2018年4月13日提交的国际专利申请号PCT/CN2018/082947的优先权权益，其公开内容全文以引用方式并入本文中。以ASCII文本文件提交序列表以下以ASCII文本文件提交的内容的全文以引用方式并入本文中：序列表的计算机可读取形式(CRF)(文件名：776902000342SEQLIST.TXT，记录日期：2019年4月11日，大小：426KB)。
本专利技术涉及癌症免疫疗法的领域。具体而言，本专利技术提供获得TCR的方法、肿瘤特异性TCR、经工程改造的免疫细胞、药物组合物、以及用于治疗癌症的试剂盒。
技术介绍
与血液性癌症不同，实体肿瘤缺乏由一般嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor,CAR)识别的细胞表面抗原。来自实体肿瘤的细胞内抗原必须通过HLA分子以HLA-抗原表位复合物呈现在细胞表面上，此类HLA-抗原表位复合物是由肿瘤特异性T细胞表面上的T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)特异性识别，从而由肿瘤特异性T细胞引发抗肿瘤细胞毒性。在2018年2月前，有75项关于过继(adoptive)免疫细胞的临床试验，此类过继免疫细胞经工程改造而具有肿瘤特异性TCR，以用于治疗癌症。靶标包括肿瘤相关抗原、肿瘤相关病毒抗原、以及新抗原。适应症包括许多常见类型的实体肿瘤。目前在临床试验中的TCR-T细胞的示例包括靶向WT1/HLA-A*0201复合物的TCR-T(JunoTherapeutics)，其是用于治疗急性骨髓性白血病(acutemyeloidleukemia,AML)和非小细胞肺癌；靶向MAGE-A3/A6/HLA-DPB1*0401复合物的TCR-T(Kite)，其是用于治疗恶性实体肿瘤；以及靶向MAGE-A4/HLA-A*0201的TCR-T(Adaptimmune)，其是用于治疗恶性实体肿瘤。在本文中所参照的所有出版物、专利、专利申请案、以及已公开专利申请案的公开内容全文特此以引用方式并入本文中。
技术实现思路
本专利技术提供方法、组合物、以及试剂盒以用于获得一种或多种特异性识别来自个体的肿瘤抗原肽的T细胞受体(TCR)，该个体已在临床上受益于免疫疗法，诸如多抗原特异性细胞疗法(MultipleAntigenSpecificCellTherapy，“MASCT”)。本专利申请的一个方面提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的T细胞受体(TCR)的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一树突细胞(dendriticcell,DC)群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(MASCT)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群之间的比率不大于约30:1(诸如约10:1至约20:1、或约15:1、或约20:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该第一共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该第一共培养基包含IL-2和抗PD-1抗体。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(antigenpresentingcell,APC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子。在一些实施方案中，该细胞因子为IFNγ。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，IL-2或多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，IL-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该抗CD3抗体是OKT3。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该一种或细胞因子包括IL-2。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体(例如，SHR-1210)。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)的群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中使该第二肿瘤抗原特异性T细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。在一些实施方案中，此类APC是PBMC、DC、或细胞系APC。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群之间的比率为约1:1至约20:1。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群共培养约5至9天。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)和抗CD3抗体。在一些实施方案中，该第三共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及OKT3。在一些实施方案中，该第三共培养基包含IL-2和OKT3。在一些实施方案中，重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得特异性地识别目标肿瘤抗原肽的多种T细胞受体(TCR)的方法，所述方法包括：/na)第一共培养步骤，所述第一共培养步骤包括将载有所述目标肿瘤抗原肽的第一树突细胞(DC)群与来自个体的T细胞群共培养以获得第一共培养物；/nb)富集步骤，所述富集步骤包括使所述第一共培养物经受富集过程以获得经富集的活化T细胞；/nc)第二共培养步骤，所述第二共培养步骤包括将所述经富集的活化T细胞与载有所述目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％的所述肿瘤抗原特异性T细胞对所述目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及/nd)测序步骤，所述测序步骤包括使所述肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序以识别编码TCRα和TCRβ的多对基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供所述多种T细胞受体；/n其中所述个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(MASCT)，所述MASCT包括向所述个体施用有效量的活化T细胞，所述活化T细胞通过将T细胞群与载有包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180413 CN PCT/CN2018/0829471.一种获得特异性地识别目标肿瘤抗原肽的多种T细胞受体(TCR)的方法，所述方法包括：
a)第一共培养步骤，所述第一共培养步骤包括将载有所述目标肿瘤抗原肽的第一树突细胞(DC)群与来自个体的T细胞群共培养以获得第一共培养物；
b)富集步骤，所述富集步骤包括使所述第一共培养物经受富集过程以获得经富集的活化T细胞；
c)第二共培养步骤，所述第二共培养步骤包括将所述经富集的活化T细胞与载有所述目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％的所述肿瘤抗原特异性T细胞对所述目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及
d)测序步骤，所述测序步骤包括使所述肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序以识别编码TCRα和TCRβ的多对基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供所述多种T细胞受体；
其中所述个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(MASCT)，所述MASCT包括向所述个体施用有效量的活化T细胞，所述活化T细胞通过将T细胞群与载有包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一共培养步骤在所述富集步骤之前进行约1至约3天。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第一DC群之间的比率不超过约30:1。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第一DC群与所述T细胞群在第一共培养基中共培养，所述第一共培养基包含一种或多种细胞因子和免疫检查点抑制剂。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述富集步骤包括使所述第一共培养物与载有所述目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)接触以获得经刺激的共培养物，以及使用特异性地识别细胞因子的配体从所述经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞因子是IFNγ。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述经富集的活化T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述经富集的活化T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第二DC群共培养约12至25天。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二共培养步骤包括将载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第二DC群与所述经富集的活化T细胞群在初始第二共培养基中共培养以提供第二共培养物，所述初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体添加到所述第二共培养物以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。


10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述第二共培养步骤开始后不超过约3天，将所述抗CD3抗体添加到所述第二共培养物。


11.据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法还包括第三共培养步骤，所述第三共培养步骤包括将所述肿瘤抗原特异性T细胞群与载有目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)群共培养以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中所述第二肿瘤抗原特异性T细胞群在所述测序步骤中经受下一代测序。


12.根据权利要求11所述的方法，其中所述APC是PBMC、DC或细胞系APC。


13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述APC群之间的比率为约1:1至约20:1。


14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中将所述肿瘤抗原特异性T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述APC群共培养约5至9天。


15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中将所述肿瘤抗原特异性T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述APC群在第三共培养基中共培养，所述第三共培养基包含一种或多种细胞因子和抗CD3抗体。


16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，重复所述第三共培养步骤。


17.根据权利要求1-16所述的方法，所述方法还包括从所述目标肿瘤抗原肽识别目标肿瘤表位，其中所述目标肿瘤表位引发所述经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与所述目标肿瘤表位接触以获得载有所述目标肿瘤抗原肽的所述APC群。


18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述下一代测序是单细胞测序。


19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述个体在接受所述MASCT之后具有部分反应(PR)、完全反应(CR)或稳定疾病(SD)。


20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述MASCT包括：将载有包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养以获得活化T细胞群。


21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述MASCT包括：
(i)将载有包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群在初始共培养基中共培养以提供共培养物，所述初始共培养基包含一种或多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及
(ii)在所述共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加到所述共培养物，从而获得所述活化T细胞群。


22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述MASCT包括：
(i)使DC群与包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽接触以获得载有所述多种肿瘤抗原肽的DC群；以及
(ii)在包含MPLA的DC成熟培养基中培养载有所述多种肿瘤抗原肽的所述DC群。


23.根据权利要求22所述的方法，其中所述DC成熟培养基包含INFγ、MPLA和PGE2。


24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述MASCT包括向所述个体施用有效量的载有所述多种肿瘤抗原肽的所述DC。


25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述个体先前已接受所述MASCT至少三次。


26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中在所述下一代测序之前用载有所述目标肿瘤抗原肽的APC刺激所述肿瘤抗原特异性T细胞。


27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中并行地获得特异性地识别多种目标肿瘤抗原肽的TCR。


28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，所述方法还包括在宿主免疫细胞中表达编码TCRα和TCRβ的每对基因以提供表达TCR的经工程化改造的免疫细胞；以及评估所述经工程化改造的免疫细胞对所述目标肿瘤抗原肽的反应。


29.一种获得特异性地识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，所述方法包括根据权利要求28所述的方法，其中基于表达所述TCR的所述经工程化改造的免疫细胞对所述目标肿瘤抗原肽的所述反应来选择所述TCR。


30.根据权利要求29所述的方法，所述方法还包括确定所述TCR的HLA限制。


31.根据权利要求29或30所述的方法，所述方法还包括所述TCR的亲和力成熟。


32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，所述方法还包括增强所述TCR中的所述TCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：周向军，韩研妍，梁小玲，陈锡和，
申请(专利权)人：深圳源正细胞医疗技术有限公司，恒瑞源正深圳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44