γδT细胞的制造方法技术

本发明专利技术提供从人工多能干细胞制造γδT细胞的方法，其中，所述人工多能干细胞来源于αβT细胞以外的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】γδT细胞的制造方法
本专利技术涉及从人工多能干细胞制造γδT细胞的方法、从人工多能干细胞分化而成的γδT细胞及包含该细胞的细胞群等。
技术介绍
近年来，免疫细胞治疗作为针对癌症的治疗方法而受到关注。所谓免疫细胞治疗，是将在患者的体外增殖及活化的免疫细胞施予至患者，使该免疫细胞攻击癌细胞的治疗方法。免疫细胞治疗具有与以往的三大疗法即外科治疗、放射线治疗、化学治疗相比几乎没有副作用这样的优点。免疫细胞治疗中存在各种治疗方法，其中，使用了负责自然免疫、对癌细胞具有细胞损伤活性的γδT细胞的治疗受到关注。γδT细胞治疗中，为了实现该细胞治疗，期望开发用于高效地制造并稳定地供给该细胞的制造方法，然而，虽然已知有仅筛选患者的血液中的γδT细胞的方法(将血液细胞在含有唑来膦酸及IL-2的培养基中培养的方法(专利文献1))，但据本申请的专利技术人所知，尚未报道过从干细胞制造γδT细胞的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2006/006720号小册子
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题为提供从干细胞制造γδT细胞的方法。另外，本专利技术的课题为提供从干细胞分化而成的γδT细胞及包含该细胞的细胞群。用于解决课题的手段本申请的专利技术人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过从αβT细胞以外的细胞诱导人工多能干细胞、进而将该细胞诱导为T细胞，能够高效地获得γδT细胞。另外，通过向如此得到的γδT细胞中导入嵌合抗原受体(CAR)基因而制作了表达该CAR的γδT细胞，结果表明，该γδT细胞针对导入前的γδT细胞难以识别及损伤的癌细胞也显示出高的细胞损伤性。本申请的专利技术人基于上述见解，进一步反复进行研究，结果完成了本专利技术。即，本专利技术提供以下方案。[1]从人工多能干细胞制造γδT细胞的方法，其中，所述人工多能干细胞来源于αβT细胞以外的细胞。[2]如[1]所述的方法，其包括以下的步骤：步骤(1)，从αβT细胞以外的细胞建立人工多能干细胞；步骤(2)，使步骤(1)中建立的人工多能干细胞分化为T细胞。[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，所述αβT细胞以外的细胞为αβT细胞以外的单个核细胞(mononuclearcell)。[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述αβT细胞以外的细胞为单核细胞(monocyte)。[5]如[2]～[4]中任一项所述的方法，其包括下述步骤：向所述步骤(1)及(2)中任一个步骤中得到的细胞中导入识别并结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的核酸，所述核酸为：(i)编码αTCR的核酸及编码βTCR的核酸；(ii)编码γTCR的核酸及编码δTCR的核酸；以及/或者(iii)编码CAR的核酸。[6]如[5]所述的方法，其中，所述γTCR为Vγ9TCR，并且所述δTCR为Vδ2TCR。[7]如[1]～[6]中任一项所述的方法，其包括下述步骤：向所述步骤(1)及(2)中任一个步骤中得到的细胞中导入编码包含IL-15及IL-15Rα的融合蛋白的核酸。[8]来源于人工多能干细胞的γδT细胞，其中，所述人工多能干细胞来源于αβT细胞以外的细胞。[9]γδT细胞，其是通过[1]～[7]中任一项所述的方法制造的。[10]如[8]或[9]所述的细胞，其中，所述αβT细胞以外的细胞为αβT细胞以外的单个核细胞。[11]如[8]～[10]中任一项所述的细胞，其中，所述αβT细胞以外的细胞为单核细胞。[12]如[8]～[11]中任一项所述的细胞，其中，所述γδT细胞表达Vγ9TCR及Vδ2TCR。[13]如[8]～[12]中任一项所述的细胞，其中，所述γδT细胞表达CAR。[14]如[8]～[13]中任一项所述的细胞，其中，所述γδT细胞表达包含IL-15及IL-15Rα的融合蛋白。[15]细胞群，其是全部细胞的至少90％以上为γδT细胞的细胞群，其中，所述γδT细胞为从来源于αβT细胞以外的细胞的人工多能干细胞分化而成的细胞。[16]药物，其含有[8]～[14]中任一项所述的细胞或[15]所述的细胞群。[17]如[16]所述的药物，其用于肿瘤的预防或治疗。[18]细胞的杀伤剂，其含有[8]～[14]中任一项所述的细胞或[15]所述的细胞群。[19]如[8]～[14]中任一项所述的细胞或[15]所述的细胞群，其用于肿瘤的预防或治疗。[20][8]～[14]中任一项所述的细胞或[15]所述的细胞群在肿瘤的预防剂或治疗剂的制造中的用途。[21]肿瘤的预防或治疗方法，其包括施予[8]～[14]中任一项所述的细胞或[15]所述的细胞群。专利技术效果根据本专利技术，可提供从人工多能干细胞制造γδT细胞的方法、从人工多能干细胞分化而成的γδT细胞及包含该细胞的细胞群等。此外，通过上述方法制造的γδT细胞之中，表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞可在体外(invitro)及体内显示特异于CAR所识别的抗原的高细胞损伤活性。附图说明[图1]图1示出使用抗体组(Vδ1MyltenyiFITC、Vδ2MyltenyiAPC、γδTCRBDBV510、CD3BioLegendAPC/Cy7及αβTCReBioscienceFITC)将获得的细胞染色的结果。涂实的峰表示非染色组的结果，空心(blank)的峰表示使用了各抗原特异性抗体的染色结果。[图2]图2示出使用抗体组(Vδ1MyltenyiFITC、Vδ2MyltenyiAPC、γδTCRBDBV510、CD3BioLegendAPC/Cy7及αβTCReBioscienceFITC)将获得的细胞染色后的流式细胞术的结果。[图3]图3示出获得的γδT细胞的细胞损伤活性的测定结果。纵轴表示细胞损伤活性(％)，横轴表示相对于靶细胞数量而言的混合的γδT细胞数量的比例。[图4]图4示出来源于iPS细胞的γδT细胞(iγδT细胞)的细胞增殖的测定结果。纵轴表示细胞增殖率，横轴表示自来自抗CD3抗体(UCHT1)及抗CD30抗体的刺激开始日起经过的天数。[图5]图5示出向iPS细胞中导入Vγ9Vδ2TCR基因并使其分化而成的γδT细胞(iγ9δ2T细胞)的细胞膜表面上的CD3及γδTCR分子的表达。[图6]图6示出向来源于iPS细胞的造血祖细胞(HPC)中导入Vγ9Vδ2TCR基因并使其分化而成的γδT细胞(iHγ9δ2T细胞)的细胞膜表面上的CD3及γδTCR分子的表达。[图7]图7示出使抗CD19-CAR基因表达的iγδT细胞(iCD19CAR/IL-15γδT细胞)的细胞增殖的测定结果。纵轴表示细胞数量，横轴表示自来自抗CD3抗体(UCHT1)及抗CD30抗体的刺激开始日起经过的天数。[图8]图8示出使抗CD19-CAR基因表达的iHγ9δ2T细胞(i本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从人工多能干细胞制造γδT细胞的方法，其中，所述人工多能干细胞来源于αβT细胞以外的细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180713 JP 2018-133727;20190625 JP 2019-1178911.从人工多能干细胞制造γδT细胞的方法，其中，所述人工多能干细胞来源于αβT细胞以外的细胞。


2.如权利要求1所述的方法，其包括以下的步骤：
步骤(1)，从αβT细胞以外的细胞建立人工多能干细胞；
步骤(2)，使步骤(1)中建立的人工多能干细胞分化为T细胞。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述αβT细胞以外的细胞为αβT细胞以外的单个核细胞。


4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述αβT细胞以外的细胞为单核细胞。


5.如权利要求2～4中任一项所述的方法，其包括下述步骤：
向所述步骤(1)及(2)中任一个步骤中得到的细胞中导入识别并结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的核酸，所述核酸为：
(i)编码αTCR的核酸及编码βTCR的核酸；
(ii)编码γTCR的核酸及编码δTCR的核酸；以及/或者
(iii)编码CAR的核酸。


6.如权利要求5所述的方法，其中，所述γTCR为Vγ9TCR，并且所述δTCR为Vδ2TCR。


7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其包括下述步骤：向所述步骤(1)及(2)中任一个步骤中得到的细胞中导入编码包含IL-15及IL-15Rα的融合蛋白的核酸。


8.来源于人工多能干细胞的γδT细胞，其中，所述人工多能干细胞来源于αβT细胞以外的细胞。

【专利技术属性】
技术研发人员：金子新，入口翔一，上田树，葛西义明，林哲，中山和英，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP