FC-ε CAR制造技术

重组NK细胞，特别是重组NK‑92细胞表达具有FcεRIγ的细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。值得注意的是，具有FcεRIγ的细胞内结构域的CAR构建体具有显著延长的表达持续时间和随时间显著延长的细胞毒性。CAR可以从RNA和DNA表达，优选作为进一步编码CD16和细胞因子以赋予自分泌生长支持的三顺反子构建体。有利地，此类构建体还能够实现重组蛋白的高水平转染和表达，并提供方便的选择标志物，以促进重组NK/NK‑92细胞的快速生产。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】FC-εCAR本申请要求2018年5月22日提交的序列号为62/674,936的美国专利申请的优先权。序列表名为104077.0004PCT_ST25、大小为106kb的序列表的ASCII文本文件创建于2019年5月21日，通过EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，将其内容通过引用以其整体并入。
本专利技术的领域是重组核酸和包含其的细胞，以产生表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的细胞，尤其是表达具有Fcε受体γ(FcεRIγ)信号传导结构域的CAR的修饰的NK和NK-92细胞。
技术介绍
自然杀伤(NK)细胞是细胞毒性淋巴细胞，构成先天免疫系统的重要组成部分。在大多数情况下，NK细胞约占循环淋巴细胞的10％-15％，并结合并杀伤靶细胞，该靶细胞包括病毒感染细胞和许多恶性细胞。NK细胞杀伤对特定抗原没有特异性，可以在没有既往免疫敏化的情况下发生。靶向细胞的杀伤通常由细胞溶解蛋白(包括穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素)介导。自体NK细胞已经用作治疗实体。为此，从全血的外周血淋巴细胞级分中分离出NK细胞，在细胞培养物中扩增以获得足够数量的细胞，然后将其重新输注至受试者中。自体NK细胞至少在某些情况下显示出在离体治疗和体内治疗中具有中等有效性。然而，自体NK细胞的分离和生长需要大量的时间和成本。此外，并非所有NK细胞均具有细胞溶解作用，这进一步限制了自体NK细胞疗法。这些困难中的至少一些可以通过使用NK-92细胞来克服，NK-92细胞是一种细胞溶解性癌细胞系，其是在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现的，然后在体外无限增殖(Gong等人，Leukemia[白血病]8：652-658(1994))。虽然NK-92细胞是NK细胞的衍生物，但NK-92细胞缺乏正常NK细胞所具有的主要抑制受体，而保留了大部分活化受体。但是，NK-92细胞不会攻击正常细胞，也不会引发人体无法接受的免疫排斥反应。由于这些预期特性，NK-92细胞被详细表征，并被探索用作治疗某些癌症的治疗剂，例如，如WO1998/049268或US2002/068044所述。区分肿瘤细胞和来源于同一组织的正常细胞的表型变化通常与特定基因产物表达方面的一种或多种变化有关，包括正常细胞表面组分的丢失或其他细胞表面组分的获得(在相应的正常非癌组织中无法检测到的抗原)。在赘生性细胞或肿瘤细胞中表达但在正常细胞中不表达的抗原或在赘生性细胞中表达的水平大大高于正常细胞中发现的水平的抗原被称为“肿瘤特异性抗原”或“肿瘤相关抗原”。此类肿瘤特异性抗原可以用作肿瘤表型的标志物。肿瘤特异性抗原包括癌症/睾丸特异性抗原(例如，MAGE、BAGE、GAGE、PRAME和NY-ESO-1)、黑素细胞分化抗原(例如，酪氨酸酶、Melan-A/MART、gp100、TRP-1和TRP-2)、突变或异常表达的抗原(例如，MUM-1、CDK4、β-连环蛋白、gp100-in4、p15和N-乙酰葡萄糖胺基转移酶V)以及在肿瘤中表达水平较高的抗原(例如，CD19和CD20)。肿瘤特异性抗原已被用作癌症免疫疗法的靶标。一种这样的疗法利用在包括T细胞和NK细胞在内的免疫细胞表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)来改善针对癌细胞的细胞毒性。CAR包含连接至至少一个细胞内信号传导结构域的单链可变片段(scFv)。scFv识别并结合靶细胞(例如癌细胞)上的抗原，并触发效应细胞活化。信号传导结构域含有基于免疫受体酪氨酸的活化结构域(ITAM)，ITAM对通过受体的细胞内信号传导非常重要。用于T细胞的第一代CAR包含一个胞质信号传导结构域。例如，T细胞中第一代CAR的一个版本包括来自Fcε受体γ(FcεRIγ)的信号传导结构域，其包含一个ITAM，而另一个版本包含来自CD3ζ的信号传导结构域，其中CD3ζ包含三个ITAM。体内和体外研究表明，CD3ζCART细胞在根除肿瘤方面比FcεRIγCART细胞更有效(例如，Haynes等人，2001，J.Immunology[免疫学杂志]166：182-187；Cartellieri等人，2010，J.BiomedandBiotech[生物医学与生物技术]，Vol.2010，文章ID956304)。然后进一步的研究表明，此类重组T细胞的完全活化和增殖需要一定的共刺激信号，并且第二代和第三代CAR将多个信号传导结构域结合到单一CAR中，以增强重组CART细胞的疗效。由于它们在检测的T细胞中文献报道的效应不太理想，因此第一代CAR和FcεRIγ信号传导结构域被大量放弃，转而使用CD3ζ组合一个或多个另外的信号传导结构域(例如，Hermanson和Kaufman2015，FrontiersinImmunol.[免疫前沿]，第6卷，文章195)。最近，选择的CAR也已经在NK细胞中表达。例如，CAR修饰的NK-92细胞已使用仅具有CD3ζ细胞内信号传导结构域的第一代CAR。这些第一代CAR-NK细胞已靶向多种抗原，包括用于B细胞淋巴瘤的CD19和CD20，用于乳腺癌、卵巢癌和鳞状细胞癌的ErbB2，用于神经母细胞瘤的GD2，以及用于多发性骨髓瘤的CD138。还已经针对几种抗原构建了来自NK-92系的第二代CAR-NK细胞，包括用于多种癌的EpCAM，用于EB(Epstein-Barr)病毒的HLA-A2EBNA3复合体，用于多发性骨髓瘤的CS1，以及用于HER2阳性上皮癌的ErbB2。在第二代NK-92CAR中，与CD3ζ一起使用的最常见的细胞内共刺激结构域是CD28。然而，由于NK细胞不自然表达CD28，因此尚不清楚CD28结构域的潜在作用。另外的第二代CAR已将4-1BB细胞内信号传导结构域与CD3ζ结合在一起，以改善NK细胞的持久性。其他人则使用与单独CD3ζ融合的ErbB2scFv、CD28和CD3ζ、或4-1BB和CD3ζ比较了不同细胞内结构域对乳腺癌细胞的功能性。他们发现，与第一代CAR相比，两种第二代构建体均具有更好的杀伤力，CD28和CD3ζ具有65％的靶标裂解，4-1BB和CD3ζ裂解了62％，单独CD3ζ杀伤了51％的靶标。在最近的研究中，还使用在NK-92细胞上表达的抗CD19CAR对4-1BB和CD28细胞内结构域用于B细胞恶性肿瘤进行了比较。还有其他人发现，CD3ζ/4-1BB构建体在细胞杀伤和细胞因子产生方面不如CD3ζ/CD28有效，突出了CD28和4-1BB共刺激结构域的不同作用。第三代NK-92CAR由具有CD3ζ、CD28和4-1BB细胞内信号传导结构域的抗CD5scFv构建，并已证明对多种T细胞白血病和淋巴瘤细胞系以及原发性肿瘤细胞具有特异性和强效的抗肿瘤活性。此类细胞还能够在T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系和原发性肿瘤细胞的异种移植小鼠模型中抑制疾病进展(TranslRes.[转化医学研究]2017年9月；187：32-43)。在进一步的实例中，WO2016/201304和WO2018/076391教导了在NK细胞和NK-92细胞中表达的第三代CD3ζCAR的用途。自体NK细胞和NK-92细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因修饰的NK细胞，该基因修饰的NK细胞包含：/n重组表达的细胞因子；/n重组表达的CD16；以及/n膜结合重组表达的嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含呈单条多肽链的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180522 US 62/674,9361.一种基因修饰的NK细胞，该基因修饰的NK细胞包含：
重组表达的细胞因子；
重组表达的CD16；以及
膜结合重组表达的嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含呈单条多肽链的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。


2.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该NK细胞是NK-92细胞。


3.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子包含IL-2或IL-15。


4.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子包含内质滞留序列。


5.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的CD16是具有158V突变的高亲和力CD16变体。


6.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含scFv。


7.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原特异性结合。


8.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD19、CD20、NKG2D配体、CS1、GD2、CD138、EpCAM、HER-2、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、MUC-1、B7-H4、ETA、MAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAP、WT-1、PSMA、NY-ESO1、CSPG-4、IGF1-R、Flt-3、CD276、CD123、PD-L1、BCMA或CD33。


9.如权利要求1-6中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与病毒特异性抗原特异性结合。


10.如权利要求9所述的基因修饰的NK细胞，其中，该病毒特异性抗原是HIV病毒、HPV病毒、RSV病毒、流感病毒、埃博拉病毒或HCV病毒的抗原。


11.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。


12.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子、重组表达的CD16和重组表达的CAR由三顺反子重组核酸表达。


13.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子和/或重组表达的CD16由整合到NK细胞基因组中的重组核酸表达。


14.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码细胞因子的第一序列部分；
编码CD16的第二序列部分；
编码嵌合抗原受体(CAR)的第三序列部分，该CAR包含呈单条多肽链的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域；并且
其中，该第一、第二和第三序列部分位于同一核酸上。


15.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该核酸是三顺反子RNA。


16.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该核酸是三顺反子DNA。


17.如权利要求14-16中任一项所述的重组核酸，其中，该细胞因子是IL-2或IL15。


18.如权利要求14-17中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳伦·H·布瓦塞尔，汉斯·G·克林格曼，班纳吉·丹达帕特，希玛蒂·钦娜彭，
申请(专利权)人：南克维斯特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US