乙型肝炎表面抗原的三维表位以及与其特异性结合的抗体制造技术

本发明专利技术涉及乙型肝炎表面抗原的特异性三维表位以及与其结合的乙型肝炎中和抗体。本发明专利技术提供的表位具有特定的三维结构。另外，本申请的三维表位不包含在施用常规疫苗或HBIg时可产生逃逸突变的“a”决定簇。因此，能够与本申请的三维表位结合的抗体极不可能允许由常规疫苗引起的疫苗逃逸突变的出现，并因此可维持持续的作用。因此，这样的抗体或疫苗组合物可有效地应用于预防和治疗HBV中，具有很大的经济价值。济价值。济价值。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】乙型肝炎表面抗原的三维表位以及与其特异性结合的抗体


[0001]本专利技术涉及乙型肝炎表面抗原(下文中简称为HBsAg)的构象表位及与其特异性结合的抗体。

技术介绍

[0002]与自发愈合的患者相比，患有慢性乙型肝炎的患者没有或有非常差的T细胞应答。已报道，这是因为由于持续暴露于过量的病毒抗原，例如乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)，所以对HBV具有特异性的T细胞消失或无法正确发挥作用。
[0003]对于慢性乙型肝炎患者，血液中的病毒颗粒达到10
10
个颗粒/ml，并且HBsAg甚至可达到100ug/ml的水平。这样的过量的病毒颗粒或HBsAg抑制了人体的免疫功能，并因此被认为是慢性肝炎的重要原因。另外，已报道，HBV颗粒或HBsAg可进入树突细胞以降低T细胞、B细胞和NK细胞的活化。另外，在使用从健康人血液中分离的树突细胞进行的实验中，观察到重组乙型肝炎表面抗原(recombinant Hepatitis B surface antigen，rHBsAg)进入树突细胞，并且这些树突细胞的活化标志物蛋白质表达降低。另外，当这些树突细胞与NK细胞和T细胞共培养时，这样的树突细胞活化细胞(例如NK细胞和T细胞)的能力也降低(Woltman AM,PLos ONE,e15324,January 5,2011)。
[0004]这种其中发生免疫功能损失或免疫耐受诱导的现象在感染有腺相关病毒
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乙型肝炎病毒(Adeno
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associated virus
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hepatitis B virus，AAV
‑
HBV)的小鼠中也观察到。令人感兴趣地，在其中注射抗HBsAg单克隆抗体以降低血液中HBsAg浓度的情况下，已经显示免疫耐受现象逐渐降低以恢复B细胞和辅助T细胞的功能。
[0005]同时，已知通过常规乙型肝炎疫苗接种产生的大多数抗体识别“a”决定簇('a'determinant)，其是HBsAg的第124至147位氨基酸之间的位点。另外，已报道，虽然“a”决定簇用作HBV的主要中和表位，但在一些患者中出现的“a”决定簇内具有突变的某些突变体可逃逸由乙型肝炎疫苗接种产生的抗体。
[0006]因此，越来越需要开发用于预防和治疗乙型肝炎的新的抗体或疫苗，其可抵消针对现有疫苗或乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitis Bimmunoglobulin，HBIg)产生的这样的逃逸突变体。特别地，为了产生和验证针对HBsAg的有效抗体，需要鉴定抗原的确切表位。

技术实现思路

[0007]技术问题
[0008]本专利技术的一个目的是提供乙型肝炎表面抗原的构象表位，以及与该表位特异性结合并对多种突变体HBsAg具有优异结合能力的抗体或其片段。
[0009]问题的解决方案
[0010]为实现上述目的，在本专利技术的一个方面中，提供了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的构象表位(conformational epitope)，以及与该表位特异性结合的乙型肝炎病毒中和抗体或其片段。
[0011]有益效果
[0012]本文中提供的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的构象表位包含对与乙型肝炎病毒中和抗体特异性结合而言重要的所有关键残基，并且维持允许表位对乙型肝炎病毒中和抗体显示出高亲和力的适当的三维结构。因此，本专利技术的表位基于其高免疫原性可用作优良的HBV疫苗组合物。另外，通过使用本专利技术的表位产生的HBV中和抗体可有效地清除血液中存在的HBsAg，并且在感染有乙型肝炎病毒的个体中诱导免疫力的恢复，从而有效地治疗乙型肝炎。另外，该抗体可与多种HBsAg变体有效地结合，从而有效地消除乙型肝炎病毒。
附图说明
[0013]图1示出了HBsAg结构的示意图。
[0014]图2示出了通过在天然琼脂糖凝胶上分析HBsAg病毒样颗粒(virus
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like particle，VLP)的特征而获得的结果。
[0015]图3示出了使用变性的HBsAg VLP和HBsAg VLP特异性抗体(GC
‑
100A)进行的分析方法。
[0016]图4示出了变性的HBsAg VLP不与HBsAg VLP特异性抗体(GC
‑
100A)结合。在此，N意指天然条件，以及D意指变性条件。
[0017]图5示出了在HBsAg VLP的构象表位上的与HBsAg VLP特异性抗体(GC
‑
100A)结合的结合位点的示意图。
[0018]图6至9示出了通过天然免疫印迹的HBsAg VLP特异性抗体(GC
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100A)与涉及16个主要氨基酸残基的被称为疫苗逃逸突变体(vaccine escape mutant)的30个点突变HBsAg之间的结合程度。
[0019]图10示出了GC
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100A和DAKO抗体与临床(“a”决定簇)变体HBsAg的结合谱。
[0020]图11至14示出了通过在HBV短期表达小鼠模型中对野生型病毒和疫苗逃逸突变体(G145R)中的HBsAg进行ELISA获得的结果。特别地，图11示出了在感染有HBV的小鼠中与hIgG的结合反应。另外，图12示出了确定了HBsAg VLP特异性抗体(GC
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100A)与在感染有HBV的小鼠中产生的HBsAg VLP良好结合的结果。另外，图13示出了在感染有HBV疫苗逃逸突变体(G145R)的野生型小鼠中与hIgG的结合反应。另外，图14示出了确定了HBsAg VLP特异性抗体(GC
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100A)与在感染有HBV疫苗逃逸突变体(G145R)的野生型小鼠中产生的HBsAg VLP良好结合的结果。在此，Y轴意指以IU/mL表示的血液中HBsAg的浓度。X轴意指天数。在第1天，进行流体动力学注射(hydrodynamic injection)(注射DNA)；以及在第2天，进行IgG(其为对照)或GC
‑
100A的施用。同一实验中的每条线表示每个个体。
[0021]图15至18示出了通过HBV DNA的定量确定了在HBV短期表达小鼠模型中消除野生型病毒和疫苗逃逸突变体(G145R)的能力的结果。特别地，图15示出了确定了在感染有HBV的小鼠中通过hIgG未消除HBV的结果。另外，图16示出了确定了在感染有HBV的小鼠中通过GC
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100A有效消除了HBV的结果。另外，图17示出了确定了在感染有HBV疫苗逃逸突变体(G145R)的野生型小鼠中通过hIgG未消除HBV的结果。另外，图18示出了确定了在感染有HBV疫苗逃逸突变体(G145R)的野生型小鼠中通过GC
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100A有效消除了HBV的结果。在此，Y轴意指以拷贝数/mL表示的血液中HBV DNA的浓度。X轴意指天数。在第1天，进行流体动力学注射(注射DNA)；以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的构象表位，其包含：由通式1表示的肽，通式1Thr
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(X1)
n1
‑
A1‑
A2‑
(X2)
n2
‑
A3‑
(X3)
n3
‑
A4‑
(X4)
n4
‑
A5‑
(X5)
n5
‑
A6在所述通式中，A1为Lys或Arg；A2为Thr、Ala、Ile、Asn或Ser；A3为Ser或Leu；A4为Arg或His；A5为Ser或Phe；并且A6为Ser或Asn；并且X1至X5各自独立地为由n1至n5个相同或不同的氨基酸彼此键合形成的肽分子，其中n1为4至8的整数；n2为41至45的整数；n3为0至2的整数；n4为0至2的整数；并且n5为0至4的整数。2.权利要求1所述的HBsAg构象表位，其中A1为Lys或Arg；A2为Thr；A3为Ser；A4为Arg；A5为Ser；并且A6为Ser或Asn。3.权利要求2所述的HBsAg构象表位，其中A1为Lys，并且A6为Ser。4.权利要求1所述的HBsAg构象表位，其中n1为6；n2为43；n3为1；n4为1；并且n5为2。5.HBV疫苗，其包含以下作为活性成分：权利要求1至4中任一项所述的HBsAg构象表位。6.权利要求5所述的HBV疫苗，其中所述HBsAg构象表位是天然的。7.乙型肝炎病毒中和抗体或其片段，其与权利要求1至4中任一项所述的HBsAg构象表位特异性结合。8.权利要求7所述的乙型肝炎病毒中和抗体或其片段，其中所述中和抗体或其片段对疫苗逃逸突变体的感染具有治疗性作用。9.权利要求7所述的乙型肝炎病毒中和抗体或其片段，其中所述中和抗体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：金政焕，金佑眩，
申请(专利权)人：株式会社绿十字，
类型：发明
国别省市：