用于腺相关病毒产生的悬浮系统技术方案

本技术涉及一种用于在无血清悬浮平台中和高滴度下产生AAV载体的产生系统。这种技术所使用的试剂包括培养基、细胞、转染试剂、AAV增强剂和裂解缓冲液，其中的每一种都被设计成从哺乳动物细胞，例如HEK293细胞的悬浮培养物中提供最大AAV产生。使用这种新系统能够递送至多约2

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于腺相关病毒产生的悬浮系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年2月22日提交的美国临时申请第62/809,407号的优先权和权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文中。

技术介绍

[0003]腺相关病毒(AAV)是一种会感染人和一些非人灵长类动物细胞的小DNA病毒。已知AAV不会引起疾病并且在人中具有低免疫原性。可以生产含有所关注的DNA序列、具有很少或没有病毒基因的AAV载体。这些优势使得AAV载体已在基因疗法和其它临床和研究目的中使用。
[0004]需要大规模产生AAV载体和产生高滴度的方法。

技术实现思路

[0005]本技术通常涉及一种在无血清悬浮平台中和高滴度下产生载体的新AAV系统。这种技术所采用的新开发的一组专有良好制造工艺(GMP)试剂包括培养基、细胞、转染试剂、AAV增强剂和裂解缓冲液，其中的每一个都被设计成从哺乳动物细胞的悬浮培养物中提供最大AAV产生。使用这种新系统能够递送至多约2
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个病毒基因组每毫升(vg/mL)的非浓缩的AAV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于腺相关病毒(AAV)载体产生的方法，所述方法包括：(a)在悬浮培养物中培养哺乳动物细胞；(b)使用转染试剂用AAV转移载体转染所述哺乳动物细胞；(c)使经转染的细胞与增强剂接触；(d)将所述经转染的细胞在悬浮培养物中培养足以表达所述AAV载体的一段时间，由此产生经转染的AAV细胞培养物；(e)从所述经转染的AAV细胞培养物中采集AAV。2.根据权利要求1所述的方法，其中采集所述AAV包括使所述经转染的AAV细胞培养物与裂解缓冲液接触。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种表面活性剂：Triton
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100、Triton
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alter、NP
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40、泊洛沙姆188(poloxamer 188)和NDSB
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201。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述裂解缓冲液包括以下中的至少一种：Tris
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HCl、柠檬酸钠、氯化钠、柠檬酸、EDTA、EDTA三钾、氢氧化钠和磷酸二氢钠。5.根据权利要求2到4中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种洗涤剂：CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、辛基硫葡萄糖苷和脱氧胆酸钠。6.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述增强剂包括以下中的一种或多种：组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙酸钠和咖啡因。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述HDAC抑制剂选自阿匹西定(apicidin)、贝利司他(belinostat)、CI
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994、CRA
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024781、姜黄素(curcumin)、帕比司他(panobinostat)、丁酸钠、苯丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A(trichostatin A)和丙戊酸。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丁酸钠、苯丁酸钠、曲古抑菌素A和/或丙戊酸。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述增强剂是在转染后约0小时与约12小时之间添加的。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转染试剂包括阳离子脂质。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述转染试剂进一步包括肽。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)进一步包括使所述细胞与转染促进剂接触。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述转染促进剂包括肽。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中以介于5:1与约1:5(体积/重量)之间的转染促进剂:DNA的比率使用所述转染促进剂。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞或HEK293细胞的衍生物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述HEK293细胞已经适于在AAV载体产生系统中进行高AAV表达。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述HEK293细胞能够以至少5
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106个细胞每毫升(个细胞/mL)的密度在悬浮培养物中生长。18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述HEK293细胞能够以至多1.1
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107个细胞每毫升(个细胞/mL)的密度在悬浮培养物中生长。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以介于约1.5
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106个细胞/mL与约5
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106个细胞/mL之间的细胞密度转染所述细胞。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中不使用辅助病毒。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在采集AAV前不对所述细胞进行离心。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞不包括大T抗原。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括对所采集的AAV进行滴定。24.根据权利要求23所述的方法，其中使用定量PCR对所述AAV进行滴定。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述所采集的AAV的滴度为至少约2
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个病毒基因组每毫升(vg/mL)。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述所采集的AAV的滴度介于约2
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vg/mL与约1
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vg/mL之间。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)进一步包括用包装质粒转染所述细胞。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述包装质粒包括pRC和pHelper。29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以约15毫升(mL)到约200升(L)的体积培养所述细胞。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以约1L到约10L的体积培养所述细胞。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以约15毫升(mL)到约200升(L)的体积转染所述细胞。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以约1L到约10L的体积转染所述细胞。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在生物反应器中培养所述细胞。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在支持HEK293细胞生长和扩增的培养基中培养所述细胞。35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)和/或(d)期间，使所述细胞与培养补充剂接触。36.一种腺相关病毒(AAV)产生系统，其包括：(a)密度为至少约2
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106个细胞/mL的HEK293细胞；(b)AAV转移载体；(c)包装质粒；(d)增强剂，所述增强剂包括以下中的一种或多种：组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙酸钠、丁酸钠和咖啡因；以及(e)细胞培养基，所述细胞培养基支持所述HEK293细胞生长和扩增。37.根据权利要求36所述的AAV产生系统，其中所述HEK293细胞的密度介于约2
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106个细胞/mL与约2
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107个细胞/mL之间。38.根据权利要求36或37所述的AAV产生系统，其进一步包括转染试剂。39.根据权利要求38所述的AAV产生系统，其中所述转染试剂包括阳离子脂质。
40.根据权利要求38或39所述的AAV产生系统，其中所述转染试剂进一步包括肽。41.根据权利要求36到40中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：于昕，X，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：