肝脏靶向的腺病毒相关病毒载体制造技术

本发明专利技术涉及新型腺病毒相关病毒(AAV)衣壳蛋白，包含新型衣壳蛋白的AAV颗粒、编码这些衣壳蛋白的多核苷酸和表达这些衣壳蛋白的AAV载体。本发明专利技术还涉及制备表达本发明专利技术所述的新型衣壳蛋白的本文所述的AAV载体的方法及其相关治疗性使用。疗性使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝脏靶向的腺病毒相关病毒载体
[0001]本专利技术申请主张2018年5月14日提交的美国临时专利申请No.62/671,265的优先权，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
[0002]以电子形式提交的材料作为参考并入
[0003]作为公开内容的单独部分，本专利技术申请含有处于计算机-可读形式的序列表，其以其全部内容作为参考并入，并且如下表示：文件名：53120_Seqlisting.txt；大小：68,361字节；创建于：2019年5月10日。
专利

[0004]本专利技术涉及新型腺病毒相关病毒(AAV)衣壳蛋白，包含新型衣壳蛋白的AAV颗粒、编码这些衣壳蛋白的多核苷酸和表达这些衣壳蛋白的AAV载体。本专利技术还涉及制备表达本专利技术所述的新型衣壳蛋白的本文所述的AAV载体的方法及其相关治疗性使用。

技术介绍

[0005]AAV是复制-缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组为约4.7kb长，包括145个核苷酸的末端反向重复(ITR)。如通过Ruffing等人,J.Gen.Virol.,75:3385-3392(1994)所修正的，在Srivastava等人,J.Virol.,45:555-564(1983)中提供了AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列。在ITR中包含了指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列。3种AAV启动子p5、p19和p40(以它们的相对图谱位置命名)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。与单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227)结合的两个rep启动子(p5和p19)导致从rep基因产生了4种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。rep蛋白具有多种酶促性质，其最终导致病毒基因组复制。从p40启动子表达cap基因，并且它编码了3种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。可变剪接和非共有翻译起始位点导致3种相关衣壳蛋白的产生。单一共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组图谱的位置95。在Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)中综述了AAV的生命周期和遗传学。
[0006]当AAV感染人细胞时，病毒基因组可以整合到染色体19中，从而导致细胞的潜伏性感染。未发生感染性病毒的产生，除非细胞被辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)感染。就腺病毒而言，基因E1A、E1B、E2A、E4和VA提供了辅助功能。一旦被辅助病毒感染，则AAV原病毒被挽回并扩增，并且产生了AAV和腺病毒两者。
[0007]AAV具有使其作为表达免疫原性肽/多肽的疫苗载体和作为在(例如)基因疗法中将外源DNA递送至细胞的载体有吸引力的的独特特征。培养细胞的AAV感染是非细胞病的，并且人及其它动物的天然感染是隐性和无症状的。此外，AAV感染多种哺乳动物细胞，从而使得有可能体内靶向多种不同组织。与克隆DNA在质粒中一样，AAV前病毒基因组是感染性的，这使得构建重组基因组是可行的。此外，因为指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR内，因此内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)中的一些或全部可以被外源DNA替换，如含有启动子、所关心的DNA和多腺苷酸化信号
的基因盒。可以提供反式rep和cap蛋白。AAV的另一种显著特征在于它是极稳定和强健的病毒。它易于耐受用于使腺病毒失活的条件(56℃至65℃，数小时)，这使得rAAV-载体的冷藏不那么至关重要。AAV甚至可以冻干。最后，AAV-感染的细胞不耐受超感染。
[0008]AAV载体在多种哺乳动物基因疗法应用中获得使用，并且需要在基因疗法应用中有用的新型和/或修饰的AAV载体和相关病毒。本专利技术提供了表达本专利技术的新型AAV衣壳蛋白的新型AAV载体，和包含那些载体或衣壳蛋白的新型、非天然存在的AAV病毒粒子。
[0009]专利技术简述
[0010]本专利技术提供了新型AAV衣壳蛋白，其可以是新型VP1、VP2或VP3衣壳蛋白、包含任何这些衣壳蛋白的非天然存在的AAV病毒，和这种AAV病毒用于基因疗法应用的使用以及在制备用于基因疗法应用的药剂中的使用。在一些实施方式中，从多种哺乳动物组织分离和鉴别了AAV衣壳蛋白。某些新型哺乳动物-来源的AAV衣壳VP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-7所示，并且各个VP2和VP3序列的相关位置也如本文所述。在本文中，将新型衣壳蛋白统称为“本专利技术的AAV衣壳蛋白”。
[0011]在一个实施方式中，本专利技术提供了腺病毒相关病毒(AAV)，其具有衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与(i)SEQ ID NO：1-7中的任一项，(ii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP2区或者(iii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP3区具有至少95％的同一性的氨基酸序列，并且还具有转基因，其中所述转基因由可操作性地连接至在宿主细胞中以控制异源基因表达的调控序列的异源基因组成。在另一个实施方式中，所述衣壳蛋白具有(i)SEQ ID NO：1-7中的任一项，(ii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP2区或者(iii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP3区的氨基酸序列。在又另一个实施方式中，所述AAV具有AAV末端反向重复序列。在其它实施方式中，AAV与生理学相容的载体混合。
[0012]在另一个实施方式中，本专利技术提供了将转基因递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与本文所公开的任何AAV接触的步骤。在另一个实施方式中，本专利技术提供了治疗患有与内源蛋白的异常活性有关的病症或疾病的对象的方法，其步骤包括向所述对象施用有效量的本文所公开的AAV，其中所述AAV具有编码所述蛋白的生物学活性拷贝的转基因。在又另一个实施方式中，所述方法包括将转基因递送至肝细胞。
[0013]在其它实施方式中，本专利技术提供了用于将转基因递送至细胞，如肝细胞的包含任何本专利技术所述的AAV的组合物。另外，本专利技术提供了任何本专利技术所述的AAV在制备用于将转基因递送至细胞的药剂中的用途。
[0014]在一个实施方式中，本专利技术提供了分离的腺病毒相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包含(i)与SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP1氨基酸序列或SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP2或VP3区具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列或(ii)包含SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP1氨基酸序列或SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP2或VP3区。在某些实施方式中，所述衣壳蛋白连接至异源氨基酸序列。本专利技术还提供了具有或包含任何这些衣壳蛋白的非天然存在的AAV颗粒。在某些实施方式中，包含任何上述VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的非天然存在的AAV颗粒包含具有AAV末端反向重复的核酸和包含可操作性地连接至指导异源基因在宿主细胞中的表达的调控序列的异源基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.腺病毒相关病毒(AAV)，其包含衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包含与(i)SEQ ID NO：1-7中的任一项，(ii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP2区，或者(iii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP3区具有至少95％的同一性的氨基酸序列，并且还包含含有可操作性地连接至在宿主细胞中控制异源基因表达的调控序列的所述异源基因的转基因。2.根据权利要求1所述的AAV，其中所述衣壳蛋白包含(i)SEQ ID NO：1-7中的任一项，(ii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP2区，或者(iii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP3区的氨基酸序列。3.包含衣壳蛋白的腺病毒相关病毒(AAV)，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1-7中任一项所示的功能性片段，并且还包括包含可操作性地连接至控制异源基因在宿主细胞中的表达的调控序列的所述异源基因的转基因。4.根据权利要求3所述的AAV，其中所述衣壳包含可变区(VR)、位于所述可变区之间的恒定区、GBS域、SEQ ID NO：1-7中任一项所示的氨基酸序列的GH环中的一个或多个。5.包含衣壳蛋白的腺病毒相关病毒，其中所述衣壳蛋白包含通过杂交至(i)SEQ ID NO：8-14中的任一项所示的核苷酸序列，(ii)编码SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的氨基酸序列的VP2区的核苷酸序列，或者(iii)编码SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的氨基酸序列的VP3区的核苷酸序列的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，并且还包含含有可操作性地连接至控制异源基因在宿主细胞中的表达的调控序列的所述异源基因的转基因。6.根据权利要求1至5中任一项所述的AAV，还包含AAV末端反向重复。7.组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的AAV和生理学相容的载体。8.向细胞递送转基因的方法，其包括使所述细胞接触根据权利要求1-6中任一项所述的AAV。9.用于向细胞递送转基因的组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的AAV。10.根据权利要求1-6中任一项所述的AAV在制备用于向细胞递送转基因的药剂的中的用途。11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述细胞是肝细胞。12.治疗患有与内源蛋白异常活性有关的病症或疾病的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的包含衣壳蛋白的AAV，其中所述衣壳蛋白包含与(i)SEQ ID NO：1-7中的任一项，(ii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP2区或者(iii)SEQ ID NO：1-7中的任一项所示的VP3区具有至少95％的同一性的氨基酸序列，并且其中所述AAV包含编码所述蛋白的生物活性拷贝的转基因。13.治疗患有与内源蛋白异常活性有关的病症或疾病的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1-8中任一项所述的AAV。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述病症或疾病与肝细胞中表达的内源基因的异常活性有关。15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述病症或疾病选自甲型血友病、乙型血友病、威尔森氏症、遗传性血管性水肿(HAE)、α1抗胰蛋白酶缺乏和半乳糖血。16.包含编码具有与(i)SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：生物马林药物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：