【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体涉及一种crispr-frcas9蛋白突变体及应用。
技术介绍
1、crispr/cas9技术作为一种可编程的新型基因编辑手段，集成了编辑效率高、操作简单的优点，能够以高效、精准的方式进行基因组编辑，在临床疾病研究方面显示出了极大的优势。但crispr/cas9基因编辑工具仍存在一些问题，一是受限于pam识别序列，在基因组上的可靶向范围受限，对一些疾病位点无法进行精准编辑；二是现存的crispr/cas9基因编辑系统都存在较明显的脱靶效应，在基因治疗过程中存在风险，这也限制了其在临床治疗中的应用。
2、目前，通过合理的以蛋白结构为指导的定向进化可提高crispr/cas9系统的编辑效率和靶向特异性，通过该方法获得了一些高保真版本的spcas9，例如：espcas9通过使带正电荷的氨基酸残基中性化可以增强cas蛋白靶向dna的特异性；spcas9-hf1通过减少spcas9蛋白与靶dna位点之间的非特异性相互作用使spcas9的脱靶效应最小化；hypacas9通过使可感知rna-dna相互作用的rec3结构域中的保守残基簇突变为丙氨酸，以触发hnh核酸酶结构域的构象，从而降低脱靶；superfi-cas9通过突变ruvc中的一个loop环，使cas9蛋白切割错配dna的速率下降500倍。然而，尽管这些spcas9高保真变体可提高靶向基因组的精确性，但这些变体增强的特异性是通过牺牲靶点的切割效率来实现的，这表明当前的改造需要在dna靶向特异性和编辑效率之间进行权衡。因此，在不断改造spcas9
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种crispr-frcas9蛋白突变体及应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供了一种crispr-frcas9蛋白突变体，所述crispr-frcas9蛋白突变体在frcas9蛋白基础上发生v1103k、v1103r、d660a、n532a、y763a、w692a、t615a、k545a、y550a、n694a、n732a、k986a、n725a、q728a中至少一种突变。
4、本专利技术解析了天然frcas9与靶dna识别特异性的机制，鉴定了frcas9蛋白中参与异源双链结合的关键氨基酸位点。本专利技术从蛋白结构角度入手，利用冷冻电镜技术解析frcas9-sgrna-dna复合物的三维结构，解析天然frcas9为何在具有高切割效率的同时具有低脱靶效应：frcas9相较于spcas9，frcas9能够在与spcas9几乎相同的长度内容纳更长的spacer，即frcas9形成了更紧凑的sgrna-dna异源双链结构，需要更严格的异源双链配对，从而减少错配，这可能是天然frcas9特异性较强的主要原因。将上述选定的具有相互作用的氨基酸位点依次进行突变和效率检测，获得编辑效率显著升高和高特异性的新2型frcas9变体。
5、作为本专利技术所述的crispr-frcas9蛋白突变体的优选实施方式，所述crispr-frcas9蛋白突变体在frcas9蛋白基础上发生v1103k和/或n732a突变。
6、本专利技术通过以结构为指导的蛋白信息，突变与sgrna-dna异源双链有相互作用的氨基酸残基位点，最终鉴定出位于pll的v1103和位于pam远端的n732这两个氨基酸位点，并进行有目的的突变，将v1103突变为侧链更长的k（赖氨酸）用来增加磷酸锁环的结合力，将n732突变为芳香环更大更平坦的a（丙氨酸）用来增加与ts链的相互作用。现这两个位点均可在保持高特异性的同时将编辑效率提高2倍左右，即获得efrcas9变体：frcas9-v1103k-n732a。不管是与当前报道的spcas9的所有变体还是天然frcas9相比，本专利技术所得到的这一种frcas9变体是目前编辑效率最高的cas9核酸酶，同时也保留了天然frcas9的优越的高保真性。
7、作为本专利技术所述的crispr-frcas9蛋白突变体的优选实施方式，所述crispr-frcas9蛋白突变体在frcas9蛋白基础上发生v1103k和n732a突变，其氨基酸序列如seq idno.6所示。
8、本专利技术对pll中氨基酸位点进行突变，发现v1103是参与frcas9特异性编辑的关键氨基酸位点，有目的的frcas9-v1103k改造可以提高蛋白的靶向特异性。同样的，本专利技术也解析了frcas9中参与sgrna-dna异源双链体识别切割的关键氨基酸位点，通过联合v1103k进行组合突变，通过功能实验进行检测及筛选得到了编辑效率升高约2倍，并保持高保真性的efrcas9变体。
9、第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子含有编码所述的crispr-frcas9蛋白突变体的核酸序列。
10、作为本专利技术所述的核酸分子的优选实施方式，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
11、第三方面，本专利技术提供了一种表达载体，包含所述的核酸分子。
12、第四方面，本专利技术提供了一种细胞，包含所述的表达载体。
13、第五方面，本专利技术提供了一种碱基编辑器，包括所述的crispr-frcas9蛋白突变体。
14、作为本专利技术所述的碱基编辑器的优选实施方式，还包括至少一种能够结合所述的crispr-frcas9蛋白突变体的grna或sgrna。
15、第六方面，本专利技术提供了一种碱基编辑方法，利用所述的碱基编辑器进行碱基编辑。
16、优选的，利用所述的crispr-frcas9蛋白突变体和向导rna组成crispr-cas9系统进行基因编辑，或者，
17、利用所述的crispr-frcas9蛋白突变体和由串联向导rna经加工形成的向导rna组成crispr-cas9系统进行多基因位点同时基因编辑。
18、第七方面，本专利技术提供了一种crispr复合物，包括所述的crispr-frcas9蛋白突变体，grna或sgrna，和结合在所述grna上的靶序列。
19、作为本专利技术所述的crispr复合物的优选实施方式，所述grna或sgrna包括能够结合所述的crispr-frcas9蛋白突变体的同向重复序列和能够靶向靶序列的引导序列。
20、作为本专利技术所述的crispr复合物的优选实施方式，所述sgrna的核苷酸序列如seqid no.2所示。
21、第八方面，本专利技术提供了一种用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂盒，包括所述的crispr-frcas9蛋白突变体，或所述的核酸分子，或所述的表达载体，或所述的细胞，或所述的碱基编辑器，或所述的crispr复合物。
22、第九方面，本专利技术将所述的crispr-frcas9蛋白突变体、所述的核酸分子、所述的表达载体、所述的细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CRISPR-FrCas9蛋白突变体，其特征在于，所述CRISPR-FrCas9蛋白突变体在FrCas9蛋白基础上发生V1103K、V1103R、D660A、N532A、Y763A、W692A、T615A、K545A、Y550A、N694A、N732A、K986A、N725A、Q728A中至少一种突变。
2.根据权利要求1所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体，其特征在于，所述CRISPR-FrCas9蛋白突变体在FrCas9蛋白基础上发生V1103K和/或N732A突变。
3.根据权利要求2所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体，其特征在于，所述CRISPR-FrCas9蛋白突变体在FrCas9蛋白基础上发生V1103K和N732A突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有编码权利要求1所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.一种表达载体，其
7.一种细胞，其特征在于，包含如权利要求6所述的表达载体。
8.一种碱基编辑器，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体。
9.根据权利要求8所述的碱基编辑器，其特征在于，还包括至少一种能够结合所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体的gRNA或sgRNA。
10.一种碱基编辑方法，其特征在于，利用权利要求8或9所述的碱基编辑器进行碱基编辑。
11.一种CRISPR复合物，其特征在于，包括1-3任一项所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体，gRNA或sgRNA，和结合在所述gRNA或sgRNA上的靶序列。
12.根据权利要求11所述的CRISPR复合物，其特征在于，所述gRNA或sgRNA包括能够结合所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体的同向重复序列和能够靶向靶序列的引导序列。
13.根据权利要求12所述的CRISPR复合物，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
14.一种用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体，或权利要求4或5所述的核酸分子，或权利要求6所述的表达载体，或权利要求7所述的细胞，或权利要求8或9所述的碱基编辑器，或权利要求11-13任一项所述的CRISPR复合物。
15.权利要求1-3任一项所述的CRISPR-FrCas9蛋白突变体、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的细胞、权利要求8或9所述的碱基编辑器、权利要求11-13任一项所述的CRISPR复合物、权利要求14所述试剂盒在基因编辑中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种crispr-frcas9蛋白突变体，其特征在于，所述crispr-frcas9蛋白突变体在frcas9蛋白基础上发生v1103k、v1103r、d660a、n532a、y763a、w692a、t615a、k545a、y550a、n694a、n732a、k986a、n725a、q728a中至少一种突变。
2.根据权利要求1所述的crispr-frcas9蛋白突变体，其特征在于，所述crispr-frcas9蛋白突变体在frcas9蛋白基础上发生v1103k和/或n732a突变。
3.根据权利要求2所述的crispr-frcas9蛋白突变体，其特征在于，所述crispr-frcas9蛋白突变体在frcas9蛋白基础上发生v1103k和n732a突变，其氨基酸序列如seq id no.6所示。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有编码权利要求1所述的crispr-frcas9蛋白突变体的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
6.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求4或5所述的核酸分子。
7.一种细胞，其特征在于，包含如权利要求6所述的表达载体。
8.一种碱基编辑器，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的crispr-frcas9蛋白突变体。
9.根据权利要求8所述的碱基编辑器，其特征在于，还...
【专利技术属性】
技术研发人员：田瑞，赵停停，
申请(专利权)人：珠海舒桐医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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