本发明专利技术涉及一种2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，属于基因编辑技术领域。该基因编辑系统，包括Cas9蛋白、辅助蛋白、CRISPR RNA和反式激活CRISPR RNA；所述Cas9蛋白为DNA核酸内切酶，所述Cas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。本发明专利技术通过生物信息学分析，挖掘出一种Faecalibaculumrodentium中的2型CRSIPR/Cas9基因编辑系统，该基因编辑系统应用于编辑原核生物或真核生物基因，为基因编辑工具箱提供了新的选择。编辑工具箱提供了新的选择。编辑工具箱提供了新的选择。
【技术实现步骤摘要】
一种2型CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用
[0001]本专利技术涉及一种源于Faecalibaculumrodentium的2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，属于基因编辑
技术介绍
[0002]基因编辑(gene editing)技术使得DNA序列定位点进行改造成为可能，比如第一代基因编辑工具锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)，第二代基因编辑工具类似转录激活的小型核酸酶(transcription activator
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like effector nucleases, TALENs)都可以用于改造靶向基因组，但是这些方法设计困难，不易制作，成本昂贵且普适性不强。
[0003]CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas(CRISPR
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associated protein)系统，是来自古生菌和细菌的天然免疫系统，为第三代基因编辑工具。其不同于以往基因编辑工具(蛋白质
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DNA识别)，利用核酸碱基互补配对原理进行目标DNA序列的识别，引导Cas效应蛋白进行定点切割，适用性强、设计简单、成本低、效率高。Cas 蛋白包含多种不同的效应结构域(domain)，在核酸识别、稳定复合物结构、水解DNA磷酸二酯键等不同的活动中发挥作用。其中，源自化脓链球菌 (Streptococcus pyogene Cas，SpCas9)的II型CRISPR/Cas9系统因其切割效率高，成为现下应用最为广泛的CRISPR/Cas系统。这一系统通过识别并切割靶向的多核苷酸上的原间隔序列临近模块(Protospacer Adjacent Motif,PAM)序列，即“NGG”，从而留下一个平末端突出端并且影响基因编辑。
[0004]在庞大以及各色各样的宏基因组中，隐藏了尚未培养甚至尚未发现的微生物，可能存在大量的未被发现的CRISPR/Cas9系统，这些系统在原核生物和真核生物，以及在体外环境中的活性也需要得到证实。
[0005]2015年Dr.Byoung
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Chan Kim的团队从实验室小鼠C57BL/6J的粪便中分离出一种新的厌氧菌株ALO17，通过对原核生物16SrRNA基因序列的系统发育分析，发现该菌株与Holdemanellabiformis DSM 3989T，Faecalicoccuspleomorphus ATCC 29734T，Faecalitaleacylindroides ATCC 27803T,and Allobaculumstercoricanis DSM 13633T亲缘关系密切(序列相似性分别为87.4， 87.3，86.9and 86.9％)；在多项分类学证据的基础上，认定该物种为 Erysipelothricaceae科的新属，并且命名为Faecalibaculumrodentium gen.nov.,sp. nov.,近五年来，世界各国的科学家针对该菌株在肠道微生物环境与高脂饮食、肠道微生物环境与肿瘤发生这两方面领域展开了研究，但在基因编辑领域尚未报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种源于 Faecalibaculumrodentium的2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，该基因编辑系统具有新的理化性质且可以识别多种不同的PAM(protospacer adjacent motif)序列，包括NGTA和NATA。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0008]一种源于Faecalibaculumrodentium的2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，包括Cas9蛋白、辅助蛋白、crRNA：CRISPR RNA和tracrRNA：反式激活CRISPR RNA，其发挥作用的形式为Cas9蛋白和由crRNA、tracrRNA 结合形成的向导RNA的复合物
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FrCas9蛋白复合物；
[0009]所述Cas9蛋白为DNA核酸内切酶，所述Cas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
[0010]所述Cas9蛋白通过不同的核酸酶结构域在PAM序列的上游切割与sgRNA 互补的双链DNA；所述不同的核酸酶结构域为HNH样核酸酶结构域或RuvC 样核酸酶结构域。
[0011]关于具体Cas9蛋白几个关键氨基酸位点的突变情况说明：第796氨基酸位点E突变成A可变为nickase核酸酶；第796氨基酸位点E突变成A可变为nickase 核酸酶；第902氨基酸位点N突变成A可变为nickase核酸酶；第1010氨基酸位点H突变成A可变为nickase核酸酶；第1013氨基酸位点D突变成A可变为 nickase核酸酶；同时突变第796氨基酸E和第1013氨基酸位点D为A可变为无切割能力但保留结合能力的Cas9核酸酶。
[0012]所述辅助蛋白包括Cas1辅助蛋白、Cas2辅助蛋白和Csn2辅助蛋白；
[0013]所述Cas1辅助蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列；
[0014]所述Cas2辅助蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列；
[0015]所述Csn2辅助蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列。
[0016]所述CRISPR RNA由CRISPRArray转录生成，所述CRISPR RNA具有SEQ ID NO:5所示的RNA序列，或与SEQ ID NO:5核酸序列至少80％相似RNA序列；所述CRISPR Array包括直接重复序列和间隔序列，所述直接重复序列具有 SEQ ID NO:6所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:6核酸序列至少80％相似的核酸序列；所述间隔序列具有SEQ ID NO:7所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:7 核酸序列至少80％相似的核酸序列。
[0017]所述反式激活CRISPR RNA含有与CRISPR RNA直接重复序列互补的序列，所述反式激活CRISPR RNA具有SEQ ID NO:8所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的核酸序列至少70％相似的核酸序列。
[0018]crRNA和tracrRNA结合形成的向导RNA的骨架组成为crRNA直接重复序列的7
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24nt和对应长度的tracrRNA序列，两部分可由“GAAA”、“TGAA”和“AAAC”等linker融合形成sgRNA骨架，优选地，20nt本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，包括Cas9蛋白、辅助蛋白、crRNA：CRISPR RNA和tracrRNA：反式激活CRISPR RNA，其发挥作用的形式为Cas9蛋白和由crRNA、tracrRNA结合形成的向导RNA的复合物
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FrCas9蛋白复合物；所述Cas9蛋白为DNA核酸内切酶，所述Cas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述Cas9蛋白通过不同的核酸酶结构域在PAM序列的上游切割与sgRNA互补的双链DNA；所述不同的核酸酶结构域为HNH样核酸酶结构域或RuvC样核酸酶结构域。3.如权利要求1所述的2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述辅助蛋白包括Cas1辅助蛋白、Cas2辅助蛋白和Csn2辅助蛋白；所述Cas1辅助蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列；所述Cas2辅助蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列；所述Csn2辅助蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR RNA由CRISPRArray转录生成，所述CRISPR RNA具有SEQ ID NO:5所示的RNA序列，或与SEQ ID NO:5核酸序列至少80％相似RNA序列；所述CRISPR Array包括直接重复序列和间隔序列，所述直接重复序列具有SEQ ID NO:6所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:6核酸序列至少80％相似的核酸序列；所述间隔序列具有SEQ ID NO:7所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:7核酸序列至少80％相似的核酸序列。5.如权利要求1所述的2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述反式激活CRISPR RNA含有与CRISPR RNA直接重复序列互补的序列，所述反式激活CRISPR RNA具有SEQ ID NO:8所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的核酸序列至少70％相似的核酸序列。6.如权利要求1所述的2型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，crRNA和tracrRNA结合形成的向导RNA，其骨架组成为crRNA直接重复序列的7
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24nt部分的序列和tracrRNA序列；两部分可由“GAAA”、...
【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：珠海舒桐医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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