【技术实现步骤摘要】
新型CRISPR
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Cas12i系统
[0001]本专利技术涉及一种新型CRISPR
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Cas12i系统。
技术介绍
[0002]成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)基因，统称为CRISPR
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Cas或CRISPR/Cas系统，目前已被理解为对细菌和古细菌提供抗噬菌体感染的免疫。原核生物适应性免疫的CRISPR
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Cas系统是一组极其多样的效应子、非编码元件以及基因座结构，其可被工程化并用于基因编辑、靶标检测和疾病治疗等应用。张锋等发现了Cas12a蛋白(过去称为Cpf1蛋白)，可用于基因编辑和基因诊断。后来又发现了更多的Cas12蛋白，包括Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10/Cas14)、Cas12k(C2c5)，但其性能各有优劣。
[0003]尽管有现有技术，本领域仍然需要新的Cas蛋白和CRISPR
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Cas系统以满足多样化的应用需求。
技术实现思路
[0004]本专利技术通过提供新的Cas12i蛋白以及CRISPR
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Cas系统满足了上述需求。
[0005]在一个方面，本专利技术提供了一种Cas12i蛋白，其包含与SEQ ID NO:1
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10(优选地，SEQ ID NO:1
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3和6，更优选地，SEQ ID ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种Cas12i蛋白，其包含与SEQ ID NO:1
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10(优选地，SEQ ID NO:1
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3和6，更优选地，SEQ ID NO:1)中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或100％同一性的氨基酸序列。2.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其中所述Cas12i蛋白实质性缺乏(例如，保留小于50％、40％、35％、30％、27.5％、25％、22.5％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、4％、3％、2.5％、2％、1％或更低的)对应的野生型Cas12i蛋白的针对与指导序列互补的靶DNA的靶序列的间隔序列(Spacer)特异性核酸内切酶切割活性。3.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其中所述Cas12i蛋白包含在其RuvC结构域中的一个或多个氨基酸变化使得所述Cas12i蛋白实质性缺乏(例如，保留小于50％、40％、35％、30％、27.5％、25％、22.5％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、4％、3％、2.5％、2％、1％或更低的)对应的野生型Cas12i蛋白的针对与指导序列互补的靶DNA的靶序列的间隔序列(Spacer)特异性核酸内切酶切割活性。4.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，所述氨基酸变化选自氨基酸添加、插入、缺失和置换。5.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，所述Cas12i蛋白包含在与SEQ ID NO:1所示序列的第700位(D700)、第650位(D650)、第875位(E875)或第1049位(D1049)相对应的一个或多个位置处的氨基酸置换。6.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，所述氨基酸置换选自D700A/V、D650A/V、E875A/V和D1049A/V。7.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，所述氨基酸置换选自D700A，D650A，E875A和D1049A。8.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，所述氨基酸置换选自D700A、D650A、E875A、D1049A、D700A+D650A、D700A+E875A、D700A+D1049A、D650A+E875A、D650A+D1049A、E875A+D1049A、D700A+D650A+E875A、D700A+D650A+D1049A、D650A+E875A+D1049A、和D700A+D650A+E875A+D1049A。9.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，所述Cas12i蛋白包含SEQ ID NO:79
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82中任一项所示的氨基酸序列。10.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其连接至一个或多个功能结构域。11.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其中所述功能结构域与所述Cas12i蛋白的N末端和/或C末端连接。12.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其中所述功能结构域选自核定位信号(NLS)、核输出信号(NES)、脱氨酶(例如腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶)催化结构域、DNA甲基化催化结构域、组蛋白残基修饰结构域、核酸酶催化结构域、荧光蛋白、转录修饰因子、光门控因子、化学诱导型因子、染色质可视化因子、提供与靶细胞或靶细胞类型上的细胞表面部分的结合的靶向多肽。13.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其中所述功能结构域表现出修饰靶DNA的活性，其选自：核酸酶活性、甲基化活性、脱甲基化活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活
性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光裂合酶活性、糖基化酶活性、乙酰基转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性、脱豆蔻酰化活性、糖基化活性(例如，来自O
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GlcNAc转移酶)、脱糖基化活性、转录抑制活性、转录激活活性。14.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其中所述功能结构域选自腺苷脱氨酶催化结构域或胞苷脱氨酶催化结构域。15.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其中所述功能结构域是TadA8e的全长或功能性片段。16.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，所述Cas12i蛋白包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列。17.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白，其被修饰以降低或消除间隔序列非特异性核酸内切酶旁切活性。18.一种编码前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白的多核苷酸。19.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其被密码子优化以在真核细胞中表达。20.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:11
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20和SEQ ID NO:37
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46中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或100％同一性的核苷酸序列。21.一种载体，其包含前述权利要求中任一项所述的多核苷酸。22.前述权利要求中任一项所述的载体，其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。23.前述权利要求中任一项所述的载体，其中所述启动子是组成型启动子、诱导性启动子、泛在性(ubiquitous)启动子、细胞类型特异性启动子或组织特异性启动子。24.前述权利要求中任一项所述的载体，其是质粒。25.前述权利要求中任一项所述的载体，其是逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。26.前述权利要求中任一项所述的载体，其中所述AAV载体选自血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13的重组AAV载体。27.一种递送系统，其包含(1)递送介质；和(2)前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白、多核苷酸或载体。28.前述权利要求中任一项所述的递送系统，其中所述递送介质是纳米颗粒、脂质体、外泌体、微囊泡或基因枪。29.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
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Cas系统，其包含：(1)前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白或编码所述Cas12i蛋白的多核苷酸；和(2)CRISPR RNA(crRNA)或编码所述crRNA的多核苷酸，所述crRNA包含：(i)能够与靶DNA的靶序列杂交的间隔(Spacer)序列，和(ii)连接至所述间隔序列的能够引导所述Cas12i蛋白结合至所述crRNA以形成靶向所述靶序列的CRISPR
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Cas复合物的直接重复(Direct Repeat，DR)序列。30.一种CRISPR
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Cas系统，其包括一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：
(1)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白的核苷酸序列；和(2)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码CRISPR RNA(crRNA)的多核苷酸，所述crRNA包含：(i)能够与靶DNA的靶序列杂交的间隔(Spacer)序列，和(ii)连接至所述间隔序列的能够引导所述Cas12i蛋白结合至所述crRNA以形成靶向所述靶序列的CRISPR
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Cas复合物的直接重复(Direct Repeat，DR)序列；其中所述第一调控元件和所述第二调控元件位于所述CRISPR
‑
Cas载体系统的相同或不同载体上。31.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
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Cas复合物，其包含：(1)前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白；和(2)CRISPR RNA(crRNA)，所述crRNA包含：(i)能够与靶DNA的靶序列杂交的间隔(Spacer)序列，和(ii)连接至所述间隔序列的的直接重复(Direct Repeat，DR)序列；所述DR序列引导所述Cas12i蛋白结合至所述crRNA。32.前述权利要求中任一项所述的CRISPR
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Cas系统或复合物，其中所述间隔序列的长度大于16个核苷酸，优选16至100个核苷酸，更优选16至50个核苷酸，更优选16至27个核苷酸，更优选17至24个核苷酸，更优选18至24个核苷酸，最优选18至22个核苷酸。33.前述权利要求中任一项所述的CRISPR
‑
Cas系统或复合物，其中所述DR序列具有与SEQ ID NO:21
‑
30中任一项所示的DR序列的二级结构基本上相同的二级结构。34.前述权利要求中任一项所述的CRISPR
‑
Cas系统或复合物，其中所述DR序列与SEQ ID NO:21
‑
30中任一项所示的DR序列相比具有不导致二级结构发生实质性差异的核苷酸添加、插入、缺失或置换。35.前述权利要求中任一项所述的CRISPR
‑
Cas系统或复合物，其中所述DR序列包含靠近所述DR序列的3
’
末端的茎环结构，其中所述茎环结构包含5
’‑
X1X2X3X4X5NNNnNNNX6X7X8X9X
10
‑3’
(X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8，X9，X
10
是任何碱基，n是任何核碱基或缺失，N是任何核碱基)；其中X1X2X3X4X5与X6X7X8X9X
10
可彼此杂交。36.前述权利要求中任一项所述的CRISPR
‑
Cas系统或复合物，其中所述DR序列包含以下任一项的茎环结构：靠近DR序列3
’
末端的5
’‑
CUCCCNNNNNNUGGGAG
‑3’
，其中N为任何核碱基；靠近DR序列3
’
末端的5
’‑
CUCCUNNNNNNUGGGAG
‑3’
，其中N为任何核碱基；靠近DR序列3
’
末端的5
’‑
GUCCCNNNNNNUGGGAC
‑3’
，其中N为任何核碱基；靠近DR序列3
’
末端的5
’‑
GUGUCNNNNNNUGACAC
‑3’
，其中N为任何核碱基；靠近...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海南，孔祥锋，陈绮佳，
申请(专利权)人：辉二上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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