切口酶的改进或与切口酶相关的改进制造技术

公开了包含切口酶和水溶性铷盐的组合物以及进行由切口酶催化的反应的方法，所述方法包括在反应中存在水溶性铷盐。包括在反应中存在水溶性铷盐。包括在反应中存在水溶性铷盐。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】切口酶的改进或与切口酶相关的改进


[0001]本专利技术涉及可用于进行由切口酶催化的反应的组合物，和进行由切口酶催化的反应的方法。

技术介绍

[0002]许多切口酶是本领域技术人员已知的。与限制性内切酶一样，切口酶识别短的特异性DNA序列，并在相对于识别序列的固定位置切割DNA链。然而，与限制性内切酶不一样，切口酶仅切割双链多核苷酸的一条链。切口酶的实例的非详尽列表包括：Nb.Bsml、Nb.Bts、Nt.Alwl、Nt.BbvC、Nt.BstNBI和Nt.Bpu101。后一种酶可以从ThermoFisher Scientific商购获得；其它的可以从例如New England Biolabs获得。在切口酶名称中小写字母“b”或“t”表示该酶是在底链还是在顶链中产生切口(公认的惯例是，顶链从左侧的游离5
’
端延伸到右侧的游离3
’
端，其中底链在相反的取向)。
[0003]切口酶在实验室中作为研究工具是有用的，而且在某些核酸扩增技术中也找到应用，所述核酸扩增技术可以用于(尤其是)检测目的核酸序列和/或诊断疾病或健康状况。这种情况的一个实例公开于WO 2018/002649和EP 2181196中。
[0004]已知为了使任何酶以接近最佳的速率催化反应，反应条件必须适合于该酶。这包括参数，例如温度、pH和盐/金属的浓度。例如，对于许多切口酶，常规的是提供包括金属阳离子(例如Mg
2+
)的反应条件，其浓度通常在5
‑
20 mM范围内。<br/>[0005]WO2017/093326公开了使用转导缓冲剂转导细胞的方法。转导缓冲剂包含“转导化合物”、一种或多种盐和另外的渗透压诱导组分。一种或多种盐可以包含铷盐，例如氯化铷或葡萄糖酸铷。“转导化合物”是“增强目的分子向细胞中的转导的任何化合物”。

技术实现思路

[0006]在第一方面，本专利技术提供了包含切口酶和水溶性铷盐的组合物。
[0007]组合物可以作为干燥(例如冷冻干燥)固体在容器中提供，以溶解在限定体积的蒸馏水或水性溶液中，或者可以已经作为包含切口酶和一种或多种铷盐的水性溶液提供。干燥固体应理解为是指水含量小于5% w/w，优选小于3% w/w，更优选小于1% w/w水的固体组合物。溶液通常可用作包含在用于进行由切口酶催化的反应的反应混合物中的成分或组分，所述反应可以是例如如下所述的核酸扩增反应。
[0008]常规的是以浓缩形式提供这样的反应混合物组分，使得在稀释时(例如通过与反应混合物的其它组分混合)，实现期望的组分浓度。
[0009]通常，例如，浓缩的含酶组分可以以10倍浓度提供，并且当在完整的反应混合物中时稀释十倍。然而，根据本专利技术的溶液可以以1倍至约100倍浓度的任何浓度提供。
[0010]在完整的反应混合物中切口酶的最终浓度通常在0.001
‑
5 U/ul范围内，而在完整的反应混合物中铷离子的最终浓度通常在5
‑
50mM，优选10
‑
50mM，更优选10
‑
30mM范围内。因此，在根据本专利技术的组合物的10倍浓缩的溶液中，例如，切口酶的浓度可以在0.01
‑
50 U/ul
范围内，而Rb离子的浓度可以在5
‑
500mM范围内，优选100
‑
500 mM，更优选在100
‑
300mM范围内。
[0011]在本申请的优先权日尚未公开的本专利技术人的共同未决专利申请(PCT/GB2019/050005；WO2019/135074)偶然公开了包含切口酶反应混合物(尤其是包含硫酸铷)的组合物的一个特定实例。因此，在一个优选的实施方案中，所述组合物不是由以下组分组成的组合物或水性溶液： 12.5 mM MgSO4、90 mM Tris
‑
HC1 (pH 8.5)、15 mM NH4CH3CO2、15 mM Na2SO4、5 mM DTT、0.2 mg/ml BSA、0.02% Triton X
‑
100、20 mM Rb2SO4、10 mM L
‑
苏氨酸和0.008 U/
µ
l切口内切酶。
[0012]在一个实施方案中，组合物不是由上文刚刚提到以相同的相对比例但以与所述的那些不同的绝对浓度存在的组分组成的组合物或水性溶液。
[0013]在其它实施方案中，组合物不是包含以下的组合物：12.5 mM MgSO4、90 mM Tris
‑
HC1 (pH 8.5)、15 mM NH4CH3CO2、15 mM Na2SO4、5 mM DTT、0.2 mg/ml BSA、0.02% Triton X
‑
100、20 mM Rb2SO4、10 mM L
‑
苏氨酸和0.008 U/
µ
l切口内切酶，与一种或多种另外的组分的组合。
[0014]本领域技术人员将理解，上述放弃声明包括其中所述浓度的各种试剂可能与放弃保护的组合物中所述浓度相差微不足道的量(例如+/
‑
0.5%的数值)的那些组合物，例如由于制备组合物缺乏准确性。
[0015]本专利技术的组合物不同于如在WO2017/093326中公开的。现有技术文献没有明确公开包含切口酶的组合物。此外，在WO2017/093326中基本要求其中公开的缓冲剂组合物包含转导化合物。相反，在本专利技术的优选的实施方案中，组合物不包含如在WO2017/093326中定义的转导化合物。WO2017/093326提及β
‑
内酰胺酶测定(如其中所述)为适于确定物质是否是“转导化合物”。
[0016]在WO2017/093326中公开的转导化合物的实例包括非洗涤剂磺基甜菜碱(NDSB)、非洗涤剂的羧基甜菜碱(non
‑
detergent carbobetaine, NDCB)、戊酸、正丁胺和根据在WO2017/093326的第11页中公开的通式I的化合物。
[0017]本专利技术人已经发现许多不同的铷盐对切口酶的活性提供有益作用，并且本专利技术因此不限于使用任何一种特定的铷盐(应理解，铷盐在水中具有合理的溶解度，并且在与切口酶组合使用时以其它方式可接受)。在水中具有良好溶解度的铷盐包括：溴化铷、氯化铷、氟化铷和碘化铷；乙酸盐、铬酸盐、甲酸盐、氢氧化物、碳酸氢盐、硝酸盐、亚硒酸盐和硫酸盐。然而，已发现某些铷盐是特别方便的，并且这些铷盐包括以下：硫酸铷；硝酸铷；和卤化铷(尤其是氯化铷)。
[0018]组合物可以作为反应混合物的一部分原位形成(例如，以进行多核苷酸切割反应，该反应本身可以形成DNA扩增反应的一部分，例如NEAR或STAR)，或者组合物可以作为试剂盒中的组分而是现成的。“NEAR”是“切口酶扩增反应”的首字母缩写。“STAR”是“选择性温度扩增反应”的首字母缩写。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】mM NH4CH3CO2、15 mM Na2SO4、5 mM DTT、0.2 mg/ml BSA、0.02% Triton X
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100、20 mM Rb2SO4、10 mM L
‑
苏氨酸和0.008 U/
µ
l切口酶。17.根据权利要求13所述的方法，其中由所述切口酶催化的所述反应是核酸扩增反应的一部分或包含在核酸扩增反应内。18.用于进行包括切割双链寡核苷酸或多核苷酸底物的反应的反应混合物，所述反应混合物包含：切口酶；双链寡核苷酸或多核苷酸底物；和水溶性铷盐。19.根据权利要求18所述的反应混合物，其中所述铷离子以10
‑
50mM，更优选10
‑
30mM范围的浓度存在于溶液中。20.根据权利要求18或19所述的反应混合物，其中所述切口酶不是“V”型切口酶。...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：卢米拉特英国有限公司，
类型：发明
国别省市：