【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了一种引起核酸的酶消化的方法，以及可用于进行该方法的组合物。
技术介绍
1、对于本领域技术人员来说，在存在核苷三磷酸(ntp)和核酸聚合酶的情况下，在温度、ph和盐浓度的合适反应条件下，使用合适的模板分子合成核酸是一个简单的过程。
2、此外，已经操纵核酸合成反应的原理来实现合成多个拷贝的目的核酸序列的核酸扩增反应。因此，这种扩增反应能够形成以下高灵敏度测定的基础，其中目的序列最初可能以非常低的拷贝数存在于样品中，但是通过扩增程序产生多个拷贝的该序列，从而简化了对目的序列的存在的检测。
3、设计的第一个核酸扩增程序是聚合酶链反应(pcr)，随后开发了许多其他核酸扩增技术，其中大多数是等温的，从而避免了对热循环的需要，而热循环是pcr的基本要求。
4、此类等温扩增技术的非详尽列表包括：信号介导的rna扩增技术(“smart”；wo 99/037805)；基于核酸序列的扩增(“nasba”，compton 1991 nature[自然]350,91-92)；滚环扩增(“rca”，例如参见lizardi等人,1998 nature genetics[自然遗传学]19,225-232)；环介导的扩增(“lamp”，参见notomi等人,2000 nucl.acids res.[核酸研究]28,(12)e63)；重组酶聚合酶扩增(“rpa”，参见piepenberg等人,2006 plos biology[plos生物学]4(7)e204)；链置换扩增(“sda”)；解旋酶依赖性扩增(“hd
5、在‘near’中(例如，如us2009/0017453和ep 2,181,196中所披露的)，正向引物和反向引物(在us2009/0017453和ep 2,181,196中称为“模板”)与双链靶标的相应链杂交并延伸。正向引物和反向引物(过量存在)的另外拷贝与相反引物的延伸产物杂交，并且自身延伸，从而产生“扩增双链体”。如此形成的每个扩增双链体包含朝向每条链的5’端的切口位点(由切口酶切口产生的)，从而允许合成另外的延伸产物。先前合成的延伸产物可以同时与互补引物的另外拷贝杂交，从而使引物延伸，并因而产生“扩增双链体”的另外拷贝。以这种方式，可以实现指数扩增。
6、又一种扩增反应是“star”(选择性温度扩增反应)。与near不同，star不是等温的，它涉及到从最初的高温审慎地降低反应物的温度。wo 2018/002649中详细披露和描述了该反应。wo 2019/135074中披露和描述了star的定量变型，称为“qstar”。
7、ep2071034披露了一种处理溶液以便在进行扩增rna分子的扩增反应后破坏任何核糖核酸的方法，目的是降低扩增的rna污染后续rna扩增反应的风险。该方法包括在存在核糖核酸酶和至少一种核糖核酸酶抑制剂(使得核糖核酸酶被抑制)的情况下进行rna扩增反应，并随后灭活核糖核酸酶抑制剂以允许核糖核酸酶降解rna扩增产物。通过以下来示例该技术：使用猪核糖核酸酶抑制剂(“pri”)，通过加热至65℃保持10分钟而不可逆地灭活猪核糖核酸酶抑制剂，从而使得未被此类处理灭活的rna酶a随后消化扩增的rna。
技术实现思路
1、在第一方面，本专利技术提供了一种引起体外合成的核酸(优选dna)的酶消化的方法，该方法包括以下步骤：在存在暂时基本上无活性的核酸酶的情况下，将试剂合并以形成体外合成的核酸；以及随后在经过足以允许检测该体外合成的核酸的一段时间后，许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性，使得该体外合成的核酸被该核酸酶消化。
2、本领域技术人员将会理解，在进行本专利技术的方法时，在体外合成、核酸的整个时间段中核酸酶完全无活性不是必需的。例如，当对于合成而言必需的核酸试剂(尤其是引物、模板或其他寡核苷酸)大大过量存在时，归因于核酸酶介导的消化的一些损失是易于耐受的。同样，核酸酶在核酸合成反应开始时可以完全或几乎完全无活性，但是反应条件(如反应混合物中镁离子或类似二价金属阳离子的浓度)可以是使得核酸酶在合成反应过程中变得至少部分有活性的情况。
3、显而易见的是，在核酸合成过程中可以耐受的核酸酶比活性的量将取决于许多因素，包括试剂浓度、反应条件、存在的核酸酶质量、合成反应的持续时间等。因此，下面的讨论仅代表一个准则，并且本领域技术人员可以容易地通过试错法来确定在、任何特定的核酸合成反应中可以耐受的核酸酶活性水平。在优选的实施例中，核酸酶在核酸合成反应开始时将为至少90％无活性(即，将具有当核酸酶被最大限度地再活化时所表现出的比活性的不超过10％)，更优选地核酸酶在核酸合成反应开始时将为至少95％无活性，最优选地为至少99％无活性。这种核酸酶可以被认为是“基本上无活性的”。
4、反过来说，可能不需要为了获得本专利技术的益处而完全再活化核酸酶。因此，例如，就其最大比活性而言，仅被80％再活化的核酸酶可能足以彻底消化在体外核酸合成反应中合成的所有核酸。这种核酸酶可以被认为是“有基本的活性”。优选地，一旦被再活化，核酸酶将具有其最大活性的至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％。此外，虽然合成的核酸的完全消化可能是优选的，但可能不是必需的，以至于未被完全再活化的核酸酶仍然足以在根据本专利技术的方法进行核酸合成反应后大大降低被残留核酸污染的风险。
5、可以直接或间接检测合成的核酸，并且用于检测核酸的许多技术是本领域技术人员已知的，并且不构成本专利技术的一部分。间接检测方法包括，例如，检测由于体外合成的核酸的产生和/或存在而形成、稳定化或以其他方式变得可检测的分子或其他部分。检测还可以任选地包括对合成的核酸的定量。
6、已知有许多适合的检测和/或定量技术，包括：凝胶电泳、质谱法、横向流捕获、掺入带标记的核苷酸、嵌入或其他荧光染料、酶标记、电化学检测技术、分子信标和其他探针，尤其是特异性杂交的寡核苷酸或其他含核酸的分子。
7、核酸检测方法可以采用允许特异性检测双链dna的染料。在与dna或rna结合时表现出增强荧光的嵌入染料是熟知的。染料可以是例如嵌入荧光团的dna或rna，并且尤其可以包括以下：吖啶橙、溴化乙锭、pico green、碘化丙啶、sybrtmi、sybrtmii、sybrtmgold、tototm-3(噻唑橙二聚体)、oligreentm和yoyotm(噁唑黄二聚体)。
8、在优选实施例中，体外合成的核酸是核酸扩增反应的产物，尤其是非等温扩增，如star扩增(例如，如wo2018/002649所述)或qstar扩增(例如，如wo2019/1350本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引起体外合成的核酸的酶消化的方法，该方法包括以下步骤：(a)在存在暂时基本上无活性的核酸酶的情况下，将试剂合并以形成体外合成的核酸；以及(b)随后在经过足以允许检测该体外合成的核酸的一段时间后，许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性，使得该体外合成的核酸被该核酸酶消化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该核酸酶是作用于DNA底物的核酸外切酶或核酸内切酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该核酸酶需要存在水性镁和/或锰离子才有核酸酶活性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸酶选自由以下组成的组：热不稳定性盐活化核酸酶HL-SAN；HL-dsDNA酶；Cyanase核酸酶；Benzonase核酸酶；Cryonase冷启动核酸酶；以及OmniCleave核酸内切酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中体外核酸合成是合成为DNA扩增反应的产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中核酸扩增反应是等温或非热循环扩增。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过
8.根据权利要求7所述的方法，其中该生理还原剂包含二硫代苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸酶是热不稳定的，并且通过包括将该核酸酶在25℃-60℃范围内的温度下孵育至少15分钟的过程，将该核酸酶暂时灭活。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性的步骤包括将该核酸酶与水性镁和/或锰离子接触。
11.根据权利要求10所述的方法，该方法包括将该核酸酶与浓度范围为10mM至100mM的水性镁和/或锰离子接触，以促进该核酸酶的再活化。
12.一种进行体外DNA合成反应的方法，该方法包括以下步骤：形成包含进行该DNA合成反应所需的所有反应物的DNA合成反应混合物，该反应混合物进一步包含最初基本上无活性但处于可再活化的形式的DNA核酸酶；进行该DNA合成反应；以及许可或引起该DNA核酸酶恢复基本的核酸酶活性，从而降解该DNA合成反应的产物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中该体外DNA合成反应包括DNA扩增反应。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在被再活化的核酸酶消化之前，该DNA合成反应的一种或多种产物被直接或间接检测到。
15.根据权利要求12-14中任一项所述并且进一步根据权利要求1-11中任一项的方法。
16.一种用于进行根据前述权利要求中任一项所述的方法的组合物，该组合物包含DNA聚合酶、至少一种dNTP和处于可再活化形式的暂时基本上可逆灭活的核酸酶。
17.根据权利要求16所述的组合物，该组合物包含多种NTP，优选地为包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP中每一种的混合物。
18.根据权利要求16或17所述的组合物，其中该核酸酶是作用于DNA底物的核酸外切酶或核酸内切酶。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中该核酸酶选自由以下组成的组：热不稳定性盐活化核酸酶HL-SAN；HL-dsDNA酶；Cyanase核酸酶；Benzonase核酸酶；Cryonase冷启动核酸酶；以及OmniCleave核酸内切酶。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的组合物，其中该组合物作为多个基本上相同的等分试样提供，每个等分试样在单独的器皿或容器中提供。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中这些等分试样以干燥形式、冷冻形式或冻干形式提供。
22.一种用于测试样品中目的核酸序列的存在和/或量的测试装置，该测试装置包含用于进行体外核酸合成反应的一种或多种试剂，以及处于可再活化形式的暂时基本上无活性的核酸酶。
23.根据权利要求22所述的测试装置，该测试装置包含根据权利要求16-21中任一项所述的组合物。
24.根据权利要求22或23所述的测试装置，该测试装置为横向流或微流体测试装置。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种引起体外合成的核酸的酶消化的方法，该方法包括以下步骤：(a)在存在暂时基本上无活性的核酸酶的情况下，将试剂合并以形成体外合成的核酸；以及(b)随后在经过足以允许检测该体外合成的核酸的一段时间后，许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性，使得该体外合成的核酸被该核酸酶消化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该核酸酶是作用于dna底物的核酸外切酶或核酸内切酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该核酸酶需要存在水性镁和/或锰离子才有核酸酶活性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸酶选自由以下组成的组：热不稳定性盐活化核酸酶hl-san；hl-dsdna酶；cyanase核酸酶；benzonase核酸酶；cryonase冷启动核酸酶；以及omnicleave核酸内切酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中体外核酸合成是合成为dna扩增反应的产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中核酸扩增反应是等温或非热循环扩增。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括使该核酸酶与生理还原剂接触的过程，将该核酸酶暂时基本上灭活。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该生理还原剂包含二硫代苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸酶是热不稳定的，并且通过包括将该核酸酶在25℃-60℃范围内的温度下孵育至少15分钟的过程，将该核酸酶暂时灭活。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性的步骤包括将该核酸酶与水性镁和/或锰离子接触。
11.根据权利要求10所述的方法，该方法包括将该核酸酶与浓度范围为10mm至100mm的水性镁和/或锰离子接触，以促进该核酸酶的再活化。
12.一种进行体外dna合成反应的方法，该方法包括以下步骤：形成包含进行该dna合成反应所需的所有反应物的dna合成反应混合物，该反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：V·佩雷茨，A·昆蒂利亚尼，B·克雷纳克，申大伟，J·普罗文斯，
申请(专利权)人：卢米拉特英国有限公司，
类型：发明
国别省市：
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