【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于菌种保存，具体涉及河内白曲霉分生孢子的长期保存方法。
技术介绍
1、河内白曲（ aspergillus kawachii）是日本微生物学家河内源一郎于1924年从冲绳地区用于生产泡盛（琉球群岛特产的一种以大米为原料的蒸馏酒）的泡盛曲霉中分离到的一株白化突变株，属于曲霉属中的黑色组（ aspergillussection nigri）。takahashi t等研究发现 pksp基因突变可能是导致该白化表型产生的原因（takahashi t, mizutani o,shiraishi y et al. development of an efficient gene-targeting systemin aspergillus luchuensisby deletion of the non-homologous end joining system.j biosci bioeng 2011;112:529-34.）。
2、河内白曲在发酵过程中通过产生丰富的酶来分解底物。具体来说，河内白曲可以分泌如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶，这些酶能够将底物中的大分子物质分解成小而且易消化的物质。此外，白曲霉还能够产生一些代谢产物，如柠檬酸、琥珀酸等，这些代谢产物也可以促进发酵过程中其他酶的分泌。河内白曲能够产生2种α-淀粉酶（amya、asaa），可以水解淀
3、河内白曲常用麸皮为培养基进行纯种培养，制备成麸曲后在白酒酿造行业作为糖化剂使用。在生产河内白曲麸曲时，传代次数不宜过多，在母种传代至六、七代后，菌种会出现菌体营养不良、容易污染、孢子增多等退化的现象。使用这种麸曲酿造白酒会造成基酒产量减少、质量下降等不良后果。因此，要求母种使用不能超过四代，这对河内白曲的菌种保藏技术提出了要求。目前，麸曲生产企业通常采用斜面、沙土管或者大/小米孢子等方式保存河内白曲菌种，其中，斜面保存的时间较短，而沙土管或者大/小米孢子等保存方式较为繁琐，且保存效果易受到原料质量波动的影响。
技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是，提供了河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，操作简便，可在低温长期保存的条件下维持河内白曲孢子的活性和稳定性。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，包括以下步骤：
4、（1）制备麸皮汁培养基：将麸皮加入水中煮沸，过滤除去残渣后，向麸皮汁滤液中加入琼脂，得到麸皮汁培养基；
5、（2）先将灭菌的脱脂棉球浸入麸皮汁培养基中，再将河内白曲菌种孢子接种于脱脂棉球上，进行培养，培养结束后，收集孢子；
6、（3）将孢子加入冻存保护剂，混匀得到菌悬液，冷冻保存。
7、优选的，步骤（1）中，麸皮与水的质量体积比为80-120g/l，煮沸时间为25-35min；麸皮汁滤液加入琼脂前，先用柠檬酸调整ph为4.0，然后加水补足至初体积；琼脂的用量为麸皮汁培养基质量的1%-1.5%。
8、优选的，步骤（2）中，培养方法：用铁丝将脱脂棉球悬挂于灭菌的三角瓶中，用八层纱布封口，在温度30-32℃、湿度75-80%的条件下培养4-5天，培养结束后，轻轻弹动铁丝让成熟孢子从棉球上脱落，成熟孢子将落到三角瓶底部。
9、优选的，步骤（3）中，冻存保护剂为质量百分含量为1%-2%银耳多糖和18%-20%甘油的水溶液；菌悬液冷冻保存的方法：菌悬液先在4℃下保存18-30小时，然后转移到-20℃中长期冷冻保存。
10、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
11、1.本专利技术所述方法可以有效收集河内白曲的分生孢子并避免营养细胞进入到冻存管中，同时首次在冻存保护剂中加入银耳多糖，保藏效果显著提高。操作简便，不需要其他设备投入，适用于企业大规模生产时的菌种保藏。
12、2.本专利技术提供了一种获得分生孢子的培养方法，并将分生孢子作为微生物长期保藏的形式，分生孢子通常被认为是在不利环境条件下存活和传播的一种形式。保藏分生孢子相较于营养细胞具有若干优势，这些优势包括：①分生孢子是微生物的休眠形态，具有很强的抗逆性，能够抵抗极端的温度、干燥、辐射和化学物质的侵害；②分生孢子的水分含量通常较低，这降低了低温保藏时冰晶形成的风险，在冻存过程中细胞结构更加稳定；③分生孢子在休眠状态下，新陈代谢活动减缓，营养需求降低，更适合长期保存；④霉菌的营养细胞常含有几个核或甚至是异核体，因此用营养细胞保藏容易出现不纯和衰退，分生孢子是单核的，用它保藏就可避免菌体退化。
13、3.银耳多糖有助于在低温长期保存的条件下维持河内白曲孢子的活性和稳定性。银耳多糖有助于维持孢子在冻融过程中的细胞结构，减少冰晶对细胞的物理损伤，从而改善孢子的冻融稳定性。并且银耳多糖作为一种多糖类物质可以与孢子表面以及内部的蛋白质分子相互作用，维持其空间结构，防止低温下的变性。
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1.一种河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（1）中，麸皮与水的质量体积比为80-120g/L。
3.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（1）中，煮沸时间为25-35min。
4.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（1）中，麸皮汁滤液加入琼脂前，先用柠檬酸调整pH为4.0，然后加水补足至初体积。
5.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（1）中，琼脂的用量为麸皮汁培养基质量的1%-1.5%。
6.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（2）中，培养温度为30-32℃，湿度为75-80%，培养时间为4-5天。
7.如权利要求6所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：培养方法如下：用铁丝将脱脂棉球悬挂于灭菌的三角瓶中，用纱布封口，培养结束后，轻轻弹动铁丝让成熟孢子从棉球上脱落，
8.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（3）中，冻存保护剂为质量百分含量为1%-2%银耳多糖和18%-20%甘油的水溶液。
9.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（3）中，菌悬液冷冻保存的方法：菌悬液先在4℃下保存18-30小时，然后转移到-20℃中长期冷冻保存。
...【技术特征摘要】
1.一种河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（1）中，麸皮与水的质量体积比为80-120g/l。
3.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（1）中，煮沸时间为25-35min。
4.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（1）中，麸皮汁滤液加入琼脂前，先用柠檬酸调整ph为4.0，然后加水补足至初体积。
5.如权利要求1所述的河内白曲霉分生孢子的长期保存方法，其特征在于：步骤（1）中，琼脂的用量为麸皮汁培养基质量的1%-1.5%。
6.如权利要求1所述的河内白曲霉分生...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩小龙，秦宏伟，徐媛媛，宋文霞，林范学，
申请(专利权)人：济宁学院，
类型：发明
国别省市：
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