核酸酶介导的核酸修饰制造技术

本文中提供了涉及基因和基因组的分子生物学操作的技术，并且特别但非排他地涉及用于改进的基因编辑的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)方法、组合物、系统和试剂盒。系统和试剂盒。系统和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸酶介导的核酸修饰
[0001]本申请要求2020年8月19日提交的美国临时专利申请序列号63/067,379的优先权，其通过引用以其全文并入本文。


本文中提供了涉及基因和基因组的分子生物学操作的技术，并且特别但非排他地涉及用于改进的基因编辑的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)方法、组合物、系统和试剂盒。

技术介绍

CRISPR/Cas9(CRISPR相关蛋白9)广泛用于基因编辑。但是，用于基因编辑的CRISPR和相关技术在靶位点处“敲入”(KI)大片段序列(例如报告基因)的效率较低。特别地，敲入的效率常常低于1％。因此，需要改进的技术。

技术实现思路

本文中提供了涉及修饰的CRISPR/Cas9的技术，所述修饰的CRISPR/Cas9用于改善敲入核酸插入物在靶位点处的整合。在一些实施方案中，该技术使大尺寸插入物在人细胞(例如原代细胞、多能干细胞和成体干细胞)中的一系列基因座处的KI效率提高到几倍。此外，相对于例如使用常规Cas9蛋白的常规CRISPR方法，本文中提供的CRISPR技术显著减少了脱靶整合。如本文中所述，改进的CRISPR技术可用于与基因编辑研究和治疗相关的广泛应用。
[0005]相关技术已经将某些肽与基因组编辑核酸酶(GEN)融合，以使用包含GEN和肽的蛋白融合物来改善基因组编辑的功效和安全性。特别地，一些先前的技术已经将来自BRCA2基因的外显子27(也称为“BRCA2外显子27”或“BE27”)(其为一种三十六个氨基酸(AA)的肽)与酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(“spCas9”)融合。参见例如国际专利申请号PCT/US2019/030913，其通过引用并入本文。
[0006]本文提供的技术提供了新的GEN蛋白融合物，其通过在BE27多肽中引入参与同源介导修复过程的氨基酸的取代而被特异性修饰。在本文中提供的技术的实施方案的开发过程中，鉴定了对同源介导修复(HDR)过程是重要的BE27的单个氨基酸。特别地，在这些实验过程中收集的数据指示，在氨基酸位置15处的丝氨酸(SI5)和/或在氨基酸位置22处的丝氨酸(S22)特别地参与HDR。在随后的实验中，通过将spCas9与包含在S15和/或S22处的氨基酸取代的BE27变体融合来构建新的Cas9变体(“miCas9
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A”、“miCas9
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Y”和“miCas9
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D”)。特别地，通过将spCas9与BE27多肽融合来构建Cas9变体，所述BE27多肽具有丙氨酸取代氨基酸15处的丝氨酸(S15A)、酪氨酸取代氨基酸22处的丝氨酸(S22Y)或天冬氨酸取代氨基酸22处的丝氨酸(S22D)。BE27多肽变体分别命名为BE27
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S15A、BE27
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S22Y和BE27
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S22D，并与spCas9融合以产生分别命名为miCas9
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A、miCas9
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Y和miCas9
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D的新Cas9融合多肽变体(统称为“miCas9
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A/Y/D”或“miCas9变体”)。
[0007]在本文中描述的技术的实施方案开发过程中，miCas9
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A/Y/D变体产生显著减少的中靶和脱靶插入和缺失(插入缺失)事件，而不损害精确的基因编辑效率。此外，实验指示，miCas9
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A/Y/D变体还产生了提高的大尺寸基因敲入比率。因此，BE27变体肽的每种(BE27
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S15A、BE27
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S22Y或BE27
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S22D)都提供了一种通用基序，该基序可以与在核酸中产生双链断裂的任何GEN融合，以改善核酸的修饰(例如基因编辑)，例如以产生在基因组编辑应用中具有改善的功效和安全性概况的GEN
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BE27
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A/Y/D融合蛋白。
[0008]因此，本文中提供了涉及包含基因编辑核酸酶结构域和BE27变体结构域的GEN
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BE27变体融合蛋白的技术。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含CRISPR相关系统蛋白、其一部分、其同源物、或其修饰版本。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含Cas蛋白、其一部分、其同源物、或其修饰版本(例如Cas9(例如spCas9))。在一些实施方案中，所选Cas蛋白是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、C2c1、C2c2或xCas9；其一部分；其同源物；或其修饰版本。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含TALEN、其一部分、其同源物、或其修饰版本。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含ZFN、其一部分、其同源物、或其修饰版本。
[0009]在一些实施方案中，GEN
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BE27变体融合物包含一个BE27变体结构域。在一些实施方案中，GEN
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BE27变体融合物包含多个BE27变体结构域(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个、或超过20个BE27变体结构域)。在一些实施方案中，GEN
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BE27变体融合物包含多个BE27变体结构域(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个、或超过20个BE27变体结构域)，其中每个BE27变体结构域独立地选自BE27
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S15A、BE27
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S22Y和/或BE27
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S22D。在一些实施方案中，GEN
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BE27变体融合物包含1
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10个BE27变体结构域(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个BE27变体结构域)。在一些实施方案中，GEN
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BE27变体融合物包含1
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10个BE27变体结构域(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个BE27变体结构域)，并且每个BE27变体结构域独立地选自BE27
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S15A、BE27
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S22Y和/或BE27
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S22D。在一些实施方案中，BE27变体结构域包含S15A取代。在一些实施方案中，BE27变体结构域包含S22Y取代。在一些实施方案中，BE27变体结构域包含S22本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含基因编辑核酸酶结构域和BE27变体结构域的GEN
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BE27变体融合蛋白。2.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合蛋白，其中所述基因编辑核酸酶结构域包含CRISPR相关系统蛋白、其一部分、其同源物、或其修饰版本。3.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其中所述基因编辑核酸酶结构域包含Cas蛋白、其一部分、其同源物、或其修饰版本。4.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其中所述基因编辑核酸酶结构域包含选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、C2c1、C2c2和xCas9的Cas蛋白；其一部分；其同源物；或其修饰版本。5.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其中所述基因编辑核酸酶结构域包含TALEN、其一部分、其同源物、或其修饰版本。6.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其中所述基因编辑核酸酶结构域包含ZFN、其一部分、其同源物、或其修饰版本。7.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其包含一个BE27变体结构域。8.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其包含多个BE27变体结构域。9.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其包含1
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10个BE27变体结构域。10.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其中所述BE27变体结构域包含S15A取代。11.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其中所述BE27变体结构域包含S22Y取代。12.权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合物，其中所述BE27变体结构域包含S22D取代。13.包含权利要求1所述的GEN
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BE27变体融合蛋白的组合物。14.权利要求13所述的组合物，其进一步包含gRNA。15.权利要求13所述的组合物，其进一步包含供体核酸。16.权利要求13所述的组合物，其进一步包含靶核酸。17.权利要求15所述的组合物，其中所述供体核酸包含100至1000bp。18.权利要求15所述的组合物，其中所述供体核酸包含1000至10,000bp。19.权利要求13所述的组合物，其进一步包含RAD51蛋白或编码RAD51蛋白的核酸。20.权利要求13所述的组合物，其进一步包含多个RAD51蛋白。21.权利要求13所述的组合物，其进一步包含含有敲入的核酸。22.权利要求21所述的组合物，其中所述含有敲入的核酸包含供体核酸的序列。23.在靶核酸中产生敲入的方法，所述方法包括使靶核酸与GEN
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BE27变体融合蛋白接触。24.在靶核酸中产生敲入的方法，所述方法包括使靶核酸与包含GEN
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BE27变体融合蛋白和gRNA的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈育庆，徐捷，J，
申请(专利权)人：密歇根大学董事会，
类型：发明
国别省市：