在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法及试剂盒技术

本案涉及一种在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，通过设计出特异性引物再利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段，并设计出特异性探针用荧光定量PCR法对得到的目标片段进行检测。本发明专利技术通过对现有HPV核酸检测试剂盒配方的改进，使得本申请的技术方案可以仅使用5个正向引物和7个反向引物就能够在单管反应中同时实现高灵敏度、高特异性地检测8种高危型人乳头瘤病毒及另外6种高危型人乳头瘤病毒的各两个亚型。

【技术实现步骤摘要】
在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法及试剂盒
本专利技术涉及体外诊断领域，特别是涉及一种在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法及试剂盒。
技术介绍
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)是一种嗜上皮性双链DNA球形病毒，属于乳头瘤病毒科，主要感染皮肤和粘膜组织。HPV感染可引起疣、良性肿瘤和癌症。目前已有证据显示HPV感染可以导致包括宫颈癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、口咽癌等多种癌症。据国际人乳头瘤病毒参考中心(InternationalHumanPapillomavirusReferenceCenter)的最新统计，目前共发现超过200种HPV基因型。然而并不是所有的HPV基因型均可以诱发癌症。低危型HPV的感染可以诱发生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤等良性病变，只有为数不多的高危型HPV的感染可能致癌。目前了解最深入的HPV致癌的范例是女性宫颈癌。也正是因为在这方面的先驱性工作，德国科学家HaraldzurHausen于2008年获得诺贝尔生理学和医学奖。宫颈癌是发生在女性子宫下段宫颈处的恶性肿瘤，是女性中第4位高发恶性肿瘤，占妇女癌症死亡率的第4位。据国际卫生组织(WHO)的国际癌症研究中心(IARC)报道，2012年全球宫颈癌新发病例为52.8万例，约有26.6万妇女死于宫颈癌。几乎所有宫颈癌的发生都是高危型HPV的持续感染导致的，而且从最初感染到癌症的发生需要经历5到10年的时间。因此，利用以高危型HPV的遗传物质DNA作为检测对象的HPV分子诊断技术来进行宫颈癌筛查，可以提前发现病因，有效地对宫颈癌进行早期预防，从而降低发病率和死亡率。与醋酸目测检查、巴氏涂片和液基细胞学等传统宫颈癌筛查手段相比，HPV分子诊断具有灵敏度高且不依赖病理医生的主观判断的优势。因此，HPV分子诊断已经成为当前发达国家宫颈癌筛查的首选方法。HPV分子诊断技术最大的一个挑战是在保证检测灵敏度的同时有效地将高危型HPV与低危型HPV区分开来，以避免因误诊而造成的过度诊断和过度治疗以及由此对患者产生的不必要的精神压力。如前所述，目前发现的HPV基因型已经超过200种，其中只有14种高危型可以诱发宫颈癌，即HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。此外，即使是这14种高危型HPV中也并不是每一种基因型都具有相同的致癌能力。HPV16和18是其中危害最大的两个基因型，二者分别导致55％和15％的宫颈癌病例。因此，能够对HPV16和18进行分型的高危型HPV分子诊断技术对于HPV检测阳性患者的分流具有独到的优势。再有，并不是所有宫颈部位感染了高危型HPV的患者就一定会罹患宫颈癌，大部分此类感染为一过性感染，即人体自身的免疫功能可以在6到24个月内有效地将其清除。高危型HPV能否被免疫系统清除的决定因素是多方面的，既包括患者免疫系统清除感染的能力，也包括所感染HPV的病毒载量。多年来的流行病学研究显示高危型HPV感染存在一个临床阈值。病毒载量低于这一阈值的高危型HPV感染往往是一过性感染，很少会诱发宫颈癌；而病毒载量高于这一阈值的感染诱发宫颈癌的几率将大大升高。因此，用于宫颈癌早期筛查的高危型HPV分子诊断技术还应该具有一定的定量能力以区分低载量的一过性感染和可能最终诱发宫颈癌的高载量感染。目前针对HPV核酸的检测方法主要有杂交捕获法、PCR-反向点杂交法、液态芯片法和荧光定量PCR法等。针对上述用于宫颈癌早期筛查的高危型HPV分子诊断技术的特点以及其它方面的性能指标，下表中概括了这几种方法的主要优缺点：由上表可以看出，从方法学角度考虑，目前最能满足宫颈癌早期筛查要求的检测手段是荧光定量PCR技术。该技术的灵敏度和特异性均高于杂交捕获法而与PCR-反向点杂交法和液态芯片法相当。荧光定量PCR法还可以对检测对象在很大跨度范围内进行精确定量，而利用PCR终产物与固定于薄膜或微球上的探针杂交实现靶序列检测的PCR-反向点杂交法和液态芯片法则不能定量。在现有技术中，采用荧光定量PCR技术进行HPV核酸检测，需要针对每一种HPV基因型提供一个特异性探针、一个正向引物和一个反向引物，在单管反应中同时检测多个HPV基因型时，若干组特异性探针、正向引物和反向引物势必会引起更多的非特异性结合，这在一定程度上影响了检测的灵敏度和精准度。
技术实现思路
针对上述不足之处，本专利技术的目的在于提供一种针对在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法及试剂盒。本专利技术的技术方案概述如下：一种在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其中，通过设计出特异性引物再利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段，并设计出特异性探针用荧光定量PCR法对得到的目标片段进行检测。优选的是，所述的在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其中，所述特异性引物包括：用于扩增HPV16、18、31、33、39、56、59和68这8种基因型以及HPV35、45、51、52、58和66这6种基因型的各两个亚型，共20种基因型和亚型的特异性引物，正向引物数量为5个，序列为SEQIDNO.21-25。优选的是，所述的在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其中，所述特异性引物包括：用于扩增HPV16、18、31、33、39、56、59和68这8种基因型以及HPV35、45、51、52、58和66这6种基因型的各两个亚型，共20种基因型和亚型的特异性引物，反向引物数量为6个，序列为SEQIDNO.26-32。优选的是，所述的在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其中，所述特异性引物还包括有与作为人体细胞内质控的血红蛋白β基因DNA互补配对的特异性引物，正向引物为SEQIDNO.34，反向引物为SEQIDNO.35。优选的是，所述的在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其中，所述特异性探针包括：用于HPV16的特异性探针，序列为SEQIDNO.1；用于HPV18的特异性探针，序列为SEQIDNO.2；用于HPV31的特异性探针，序列为SEQIDNO.3；用于HPV33的特异性探针，序列为SEQIDNO.4；用于HPV39的特异性探针，序列为SEQIDNO.7；用于HPV56的特异性探针，序列为SEQIDNO.14；用于HPV59的特异性探针，序列为SEQIDNO.17；用于HPV68的特异性探针，序列为SEQIDNO.20；用于HPV35的两个亚型的特异性探针，序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；用于HPV45的两个亚型的特异性探针，序列为SEQIDNO.8和SEQIDNO.9；用于HPV51的两个亚型的特异性探针，序列为SEQIDNO.10和SEQIDNO.11；用于HPV52的两个亚型的特异性探针，序列为SEQIDNO.12和SEQIDNO.13；用于HPV58的两个亚型的特异性探针，序列为SEQIDNO.15和SEQIDNO.16；用于HPV66的两个亚型的特异性探针，序列为SEQIDNO.18和SEQIDNO.19。优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其特征在于，通过设计出特异性引物再利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段，并设计出特异性探针用荧光定量PCR法对得到的目标片段进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其特征在于，通过设计出特异性引物再利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段，并设计出特异性探针用荧光定量PCR法对得到的目标片段进行检测。2.根据权利要求1所述的在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其特征在于，所述特异性引物包括：用于扩增HPV16、18、31、33、39、56、59和68这8种基因型以及HPV35、45、51、52、58和66这6种基因型的各两个亚型，共20种基因型和亚型的特异性引物，正向引物数量为5个，序列为SEQIDNO.21-25。3.根据权利要求1所述的在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其特征在于，所述特异性引物包括：用于扩增HPV16、18、31、33、39、56、59和68这8种基因型以及HPV35、45、51、52、58和66这6种基因型的各两个亚型，共20种基因型和亚型的特异性引物，反向引物数量为7个，序列为SEQIDNO.26-32。4.根据权利要求1所述的在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其特征在于，所述特异性引物还包括与作为人体细胞内质控的血红蛋白β基因DNA互补配对的特异性引物，正向引物为SEQIDNO.34，反向引物为SEQIDNO.35。5.根据权利要求1所述的在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法，其特征在于，所述特异性探针包括：用于HPV16的特异性探针，序列为SEQIDNO.1；用于HPV18的特异性探针，序列为SEQIDNO.2；用于HPV31的特异性探针，序列为SEQIDNO.3；用于HPV33的特异性探针，序列为SEQIDNO.4；用于HPV39的特异性探针，序列为SEQIDNO.7；用于HPV56的特异性探针，序列为SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑岷雪，马勇，赵国栋，
申请(专利权)人：苏州国科闻普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32