棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法技术

本发明专利技术公开了棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法，在恒温条件下，来自大肠杆菌的recA重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶与引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。诊断技术方法无需PCR仪器进行扩增，只需保证恒温的反应条件即可，通过核酸电泳检测有无扩增条带或者人工观测扩增产物浑浊度或者扩增产物化学发光检测的方法进行结果分析，本检测方法操作简单、检测速度快、检测精度高，能够满足市场的需求。

A RAA diagnostic technique for iris pectoralis virus

The invention discloses a RAA diagnostic technique for Rana spinosa iridovirus. Under constant temperature, recA recombinant enzyme from Escherichia coli can bind tightly with primer DNA to form a polymerase of enzyme and primer. When the primer searches for a complementary sequence in template DNA, it opens with the help of single strand DNA binding protein. The double stranded structure of template DNA forms a new DNA complementary chain under the action of DNA polymerase. The diagnostic method does not need PCR instrument to amplify, but only needs to ensure the reaction conditions at constant temperature. The results are analyzed by nucleic acid electrophoresis to detect whether there are amplified bands or by observing the turbidity of amplified products manually or by chemiluminescence detection of amplified products. High enough to meet the needs of the market.

【技术实现步骤摘要】
棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法
本专利技术涉及虹彩病毒诊断领域，尤其是涉及棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法。技术背景棘胸蛙又名石蛙、石鸡，属脊椎动物门、两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，具有较高药用价值和食用价值，深受大家的喜爱。棘胸蛙肉质细嫩洁白，味道甘美，营养丰富，列为宾馆、酒家推荐的山珍名菜，亦是人们难得的珍稀佳肴。且具有滋补强身、清心润肺、健肝胃、补虚损，以及解热毒、治疳疾等功效，故有“山珍”之称。随着野生资源的日渐匮乏，棘胸蛙的人工养殖近年来得到较快的发展。但由于棘胸蛙养殖历史短，其人工养殖和病害防治技术仍处在摸索阶段。最早发现的虹彩病毒是1954年Xeros在英国剑桥从沼泽大蚊体内分离到的，以后又分别从金龟甲、带喙伊蚊及蛙和鱼中分离出多种虹彩病毒，由于虹彩病毒在感染的昆虫幼虫体内或在纯化浓缩的病毒沉淀物中，病毒粒子呈周期性间隔的异常整齐排列，形成晶格平面并互相重叠，当有斜射光线照射时呈现蓝色或紫色虹彩。虹彩病毒是一组从昆虫及变温脊椎动物宿主中分离到的胞质大DNA病毒，对包括鱼类、两栖类和爬行类动物在内的水生动物具有广泛的感染性，是引起水产养殖业病毒性流行病爆发的元本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法，其特征在于：所述诊断技术方法包括：提取病毒核酸：取棘胸蛙肝脏、脑组织置于保存液中并冷冻保存；将棘胸蛙肝脏、脑组织解冻后按照全自动核酸提取仪以及试剂盒使用要求提取病毒DNA并冷冻保存，作为模板备用；设计引物：RAA核酸扩增技术的引物适宜长度为28～35bp，设计4对引物；配制扩增体系：根据RAA核酸扩增检测试剂盒说明配制扩增体系；孵育：将上述反应管放入PCR仪中孵育；分析：反应结束后以掺杂有5‑(4‑羟苯基)海因与R‑(+)‑1‑苯基‑2‑丙胺的苯酚、氯仿混合物抽提反应液，然后离心取上清液进行分析。

【技术特征摘要】
1.棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法，其特征在于：所述诊断技术方法包括：提取病毒核酸：取棘胸蛙肝脏、脑组织置于保存液中并冷冻保存；将棘胸蛙肝脏、脑组织解冻后按照全自动核酸提取仪以及试剂盒使用要求提取病毒DNA并冷冻保存，作为模板备用；设计引物：RAA核酸扩增技术的引物适宜长度为28～35bp，设计4对引物；配制扩增体系：根据RAA核酸扩增检测试剂盒说明配制扩增体系；孵育：将上述反应管放入PCR仪中孵育；分析：反应结束后以掺杂有5-(4-羟苯基)海因与R-(+)-1-苯基-2-丙胺的苯酚、氯仿混合物抽提反应液，然后离心取上清液进行分析。2.根据权利要求1所述的棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法，其特征在于：所述提取病毒核酸步骤中，棘胸蛙肝脏、脑组织保存液的冷冻保存温度是-80～-85℃，提取病毒DNA的冷冻保存温度是-70～-80℃。3.根据权利要求1所述的棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法，其特征在于：所述提取病毒核酸步骤中，保存液中的物质及其含量为：二甲基亚砜1.5～1.8g/L、乙酰胺1.6～1.8g/L、1,2-丙二醇1～2g/L、PEG-8000.4～0.5g/L、色甘酸钠0.15～0.2g/L、还原性谷胱甘肽0.02～0.025g/L、卵磷脂5～6g/L、苯甲酸盐4～5g/L、硝酸钠10～12.5g/L、丙三醇14～16g/L、青霉素120～150IU/mL、链霉素100～110IU/mL，以磷酸盐缓冲液调整pH为7.1～7.3，余量为双蒸水。4.根据权利要求1所述的棘胸蛙虹彩病毒一种RAA诊断技术方法，其特征在于：所述设计引物步骤中，引物分别为：QSIV1-FTCCATGTATGCCGTGTTAAAGGACTGGQSIV1-RTTACATCCTCAACGCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑善坚，胡霭臻，李佳悦，李诗韵，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33