本发明专利技术公开了鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒包括无菌双蒸水、10×Taq反应缓冲液、dNTPs、正向引物5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′、反向引物5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3′、荧光探针5′-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-3′，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记ROX，5U/μL Taq DNA聚合酶，标准阳性模板pMCP。该试剂盒定量准确，检测速度快，仅1小时，加上DNA提取的制备，共仅需2-3小时；方法易行，操作简便；可同时进行高通量的样品检测，准确率高达98％。
【技术实现步骤摘要】
鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用
本专利技术属于鲟鱼病害检测
，更具体涉及一种鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对鲟鱼虹彩病毒进行定量检测。同时还涉及一种鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒的用途。 技术背景 鲟鱼隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)福鳍亚纲(Actinopterygii)软骨硬鳞总目(Chon drostei)鲟形目(Acipenseriformes),是现存的古老生物种群,广泛分布于北半球。全世界现有鲟鱼2科6属26种，我国分布有8种，主要分布于长江流域、黑龙江流域和新疆3个区域。随着鲟鱼野生资源的不断减少，为了保护鲟鱼资源，我国水产养殖研究人员和养殖者积极开展鲟鱼的人工繁殖和养殖工作，目前国内已开展的养殖品种有中华鲟(Acipenser sinensis Gray)、施氏鲟(A.schrenckii Brandt)、达氏鲟(A.dabryanusDuneril)等，但是随着鲟鱼养殖业的发展，鲟鱼的疾病也日渐增多，主要是由细菌和寄生虫引起[田甜，杨元金，王京树，张旭.鲟鱼病害研究进展[J].湖北农业科学，2012, 51 (3): 559-562.]。国外对鲟鱼病毒性疾病的研究相对起步较早，已报道有四种可感染鲟鱼并在鱼体内分离到的病毒，他们分别是高首鲟虹彩病毒(white sturgeon iridovirus, WSIV),高首鲟疱疫病毒-1, II (white st urgeon herpesviruses-1, II，WSHV-1, II)和伊鋳虹彩病毒(Shovenosesturgeon iridovirus, SSI V)[王获，刘红柏，卢影岩，华育平，孙大江.鲟鱼病毒性疾病研究进展[J].水产学杂志，2008，21(2):84-89.]，其中WSIV引起的鲟鱼病毒性疾病发病率和死亡率最高。随着鲟鱼的人工养殖迅速发展，引种杂交和高密度养殖可能导致国内鲟鱼病毒病的爆发，造成巨大经济损失，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法对其进行监控，保证鲟鱼养殖业的健康发展。近年来，实时突光定量PCR(real-time fluorescentquantitative PCR)以其特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，在医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面得到了广泛应用。笔者针对鲟鱼危害最严重的高首鲟虹彩病毒病建立了检测高首鲟虹彩病毒的实时荧光定量PCR检测方法，旨在对高首鲟虹彩病毒进行快速定性和定量检测。而传统的PCR法约需7个小时左右才能完成。
技术实现思路
本专利技术目的是在于提供了一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对高首鲟虹彩病毒进行定量检测。一次可检测32-384个样品，这样也减少了人力资源的浪费。 本专利技术的另一个目的是在于提供了一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒在高首鲟虹彩病毒病原检测中的应用，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2-3个小时就能完成，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。 为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施: 一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括以下组分: A).阳性模板 pMCP 为含有高首鲟虹彩病毒MCP基因519个核苷酸片段(SEQ ID N0.4所示)的pMD19-T载体，即质粒pMCP。该载体可在大肠杆菌E.coli DH5 a中增殖。 B).荧光定量反应液: 1XTaq反应缓冲液、dNTPs、正向引物和反向引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水。 正向引物为5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'； 反向引物为5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'； 荧光探针:5'-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。 优选的，突光定量反应的体系为: 1XTaq 反应缓冲液 2μ 1、2.5mmol/L dNTPs 0.4 μ 1、50 μ mol/L 正向引物和反向弓丨物各0.4μ l、25ymol/L的荧光探针0.4μ l、5U/y I Taq DNA聚合酶(λ 4 μ 1、无菌双蒸水14 U I,待测样品2 μ I。 优选的，阳性模板pMCP转化大肠杆菌Ε.coli DH5 a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A26tl (所测样品在吸收波长为260nm紫外线照射下的光密度)的定量并稀释至I X 17Copies/ μ L，-20°C保存。 在本专利技术提供高首鲟虹彩病毒快速定量检测高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET(荧光共振能量转移)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对高首鲟虹彩病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct, Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环圈数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。 一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒在制备高首鲟虹彩病毒检测试剂盒中的应用，其步骤如下: A)用标准阳性模板制备阳性标准品，并用紫外分光光度计定量； B)用DNA裂解液从待测标本中提取DNA ； C)分别取B)步中的DNA和同样量的系列稀释的A)步中的阳性标准品加入到含Taq D NA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测； D)通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。 在本专利技术中提供的高首鲟虹彩病毒快速定量检测高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒可对高首鲟虹彩病毒进行定量检测，并可替代一直沿用的传统的PCR检测方法。 本专利技术与现有技术相比具有以下优点和效果: 1、定量准确；准确性好，标准偏差为0.1，变异系数为0.52% ;最低可检测到10个病毒核酸分子拷贝数，特异性好。 2、检测速度快，仅I小时，加上DNA提取的制备，共仅需2_3小时； 3、方法易行，操作简便； 4、可同时进行高通量的样品检测，准确率高达98%。 5.在本专利技术提供检测高首鲟虹彩病毒荧光本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：正向引物为5′‑TCTCGCTTCCTGTCGTCG‑3′；反向引物为5′‑AGTTGGGCGTCAGCTTGG‑3′；荧光探针：5′‑FAM‑ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT‑ROX‑3′。
【技术特征摘要】
1.一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于: 正向引物为 5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'； 反向引物为 5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'； 荧光探针:5' -FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: A).阳性模板pMCP 为含有SEQ ID N0.4所示核苷酸的pMD19-T载体； B).荧光定量反应液: 1 X Taq反应缓冲液、dNTPs、正向引物和反向引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水。 正向引物为 5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'...
【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，曾令兵，孙爱义，解旭东，范玉顶，徐进，马杰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，镇江水中仙渔业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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