一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法技术

技术编号：10985614 阅读：92 留言：0更新日期：2015-01-31 17:14

本发明专利技术公开了一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法，能够实现同时检测出待测标本中是否含禽流感病毒H4亚型和禽流感病毒H6亚型两种病原体，并能够实时精确检测并对病毒进行定量，应用极为方便。由于引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该试剂盒适合在各级动物卫生监督所、动物疫病预防控制中心动物医院和各种动物疾病研究机构等大规模筛查的推广应用，具有广泛的应用前景。

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【技术实现步骤摘要】
—种联合检测禽流感卜4和卜6亚型的双色荧光定量试剂盒及检测方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种联合检测禽流感財和册亚型的双色荧光定量试剂盒及检测方法。
技术介绍
禽流感是由正黏病毒科流感病毒属八型病毒引起的一种禽类感染或疾病综合征。禽流感的发病情况取决于病毒的致病性及一级宿主的易感性，也受环境因素、饲养管理条件及并发疾病等因素的影响，可表现为无症状感染、轻度上呼吸道症状、产蛋量下降及急性的致病性死亡。 2008年我国南方活禽市场监测到一株鸭源亚型禽流感病毒(?相2),而从2009年起在中国南方禽流感疫情监测中分离到多株財亚型禽流感病毒(八IV〉，目前发现的禽流感亚型尚未形成对哺乳动物的全身性感染，但病毒来源复杂，抗原和基因型差异大，若亚型禽流感与高致病禽流感发生重组有可能构成巨大的危害。册亚型禽流感，在家禽中广泛存在，致病性和传播力都比较低。2013年6月，台湾出现全球首例册附患者，虽然只是个案，但表明册亚型禽流感有潜在的传染人的能力。由于!14、册禽流感不具备高致病性，且未出现规模性的哺乳动物感染，目前常规的!14和册检测方法，还是血清学诊断方法，其中最常用的为血凝(撤)及血凝抑制(?)试验，市场上鲜有相应的？(?试剂盒检测产品。血清学诊断方法建立在已发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且由于禽流感病毒具备高度变异性和重组性，很容易出现假阳性和假阴性。使用病毒分离培养的方法进行检测，操作繁琐，耗时长，难以大规模推广。用普通？(?的方法，相比前面所说的方法灵敏度和可操作性都有提升，然而后续的琼脂糖凝胶...

【技术保护点】
一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含：用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针，其序列如下：H4‑F：5’‑GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT‑3’（SEQ ID NO.1），H4‑R：5’‑CCATTCTGACAAGCCCACAA‑3’（SEQ ID NO.2），H4‑P：5’‑ TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA ‑3’（SEQ ID NO.3）；和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针，其序列如下：H6‑F：5’‑ TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA ‑3’（SEQ ID NO.4），H6‑R：5’‑ CACTGCATTGAACCATTTGAACA ‑3’（SEQ ID NO.5），H6‑P：5’‑ TGATCATGGCAATAGG –MGB‑3’（SEQ ID NO.6）；其中，荧光探针H4‑P和H6‑P的报告基团不相同。

【技术特征摘要】
1.一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含: 用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针，其序列如下:H4-F:5’ -GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’ (SEQ ID N0.1),H4-R:5’ -CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’ (SEQ ID N0.2),H4-P:5’ - TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’ (SEQ ID N0.3)；和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针，其序列如下:H6-F:5> - TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’ (SEQ ID N0.4),H6-R:5’ - CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’ (SEQ ID N0.5),H6-P:5’ - TGATCATGGCAATAGG -MGB-3’ (SEQ ID N0.6)；其中，荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包含10X双色荧光定量PCR buffer，其含有以下成分:500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl2、250mM KC1 以及 15v/v% 的 DMSO。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包含病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B ;病毒提取液A每1000ml中含有:异硫氰酸胍480g，0.1M Tris-HCl(pH 6.4) 500ml, 0.2M EDTA (pH8.0) 120ml ;病毒提取液 B 为异丙醇。4.一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR方法，包括以下步骤: 1)提取待测样品中的总RNA； 2)以得到的总RNA为模板，使用用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针 H4-F:5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’ (SEQ ID N0.1),H4-R:5’ -CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’ (SEQ ID N0.2),H4-P:5’ - TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’ (SEQ ID N0.3), 和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针H6-F:5> - TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’ (SEQ ID N0.4),H6-R:5’ - CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’ (SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐贵峰，张晓玮，
申请(专利权)人：广州维伯鑫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44

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