本发明专利技术公开了一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，包括FRET-PCR引物、探针和标准阳性模板，所述FRET-PCR引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述6-FAM探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述LCRed640探针具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；所述标准阳性模板具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。本发明专利技术提供了一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高的牛白血病的实时定量PCR的检测试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物科学
，特别涉及一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试 剂盒及其检测方法。
技术介绍
牛白血病病毒Bovine leukemia virus属于反转录病毒科Retroviridae、丁型反 转录病毒属Deltaretrovims。该病毒粒子呈球形，有囊膜，病毒含单股RNA，能产生反转录 酶，衣壳呈20面体对称。 牛白血病是由白血病病毒引起牛的一种慢性肿瘤性疾病，其特征为淋巴样细胞恶 性增生,进行性恶病质和高度病死率。此病主要发生于牛、绵羊、瘤牛、水牛、水豚，已呈世界 性分布，几乎遍及所有养牛的国家和地区。在中国的安徽、上海、江苏、广东、陕西、江西、新 疆、北京、浙江、黑龙江等地都有发病的报道。本病可以水平传播和垂直传播，近年来证明吸 血昆虫在本病传播上具有重要作用，被污染的医疗器械，如注射器和针头，可以起到机械传 播本病的作用。病毒可以通过胎盘感染胎儿，这种感染主要发生在母牛怀孕6个月以后，感 染本病的母牛所生的犊牛有3% -20%在出生时已被感染，同时，犊牛通过吸吮感染母牛的 初乳也可被感染。本病有亚临床型和临床型两种表现。亚临床型无瘤的形成，其特点是淋 巴细胞增生，部分可进一步发展为临床型。临床型的症状为病牛生长缓慢，体重减轻。腮淋 巴结或股前淋巴结常显著增大，触摸时可移动。眶后淋巴结增大可引起眼球突出。出现临 床症状的牛，通常均取死亡转归。病死牛尸体常消瘦，腮淋巴结、肩前淋巴结、股前淋巴结、 乳房上淋巴结和腰下淋巴结常肿大，被膜紧张，呈均匀灰色，柔软，切面突出。心脏、皱胃和 脊髓常发生浸润。心肌浸润常发生于右心房、右心室和心隔，色灰而增厚。循环扰乱导致全 身性被动充血和水肿。脊髓被膜外壳里的肿瘤结节，使脊髓受压、变形和萎缩。皱胃壁因肿 瘤浸润而增厚变硬。肾、肝、肌肉、神经干和其他器官亦可受损。 有研究表明，牛白血病病毒具有潜在的感染人类的风险，在人体中已经检测到了 牛白血病病毒抗体；最新研究发现，女性乳腺癌患者中，44 %患者的乳腺组织中检测到牛白 血病病毒核酸。 目前牛白血病的检测方法主要有：（1)电镜检测。可取病牛外周血液淋巴细胞培 养分离病毒，通过电镜方法检测。（2)血清学检测。应用最广泛的有琼脂凝胶扩散试验、酶 联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验。（3)分子生物学检测。主要有聚合酶链反应PCR。 在电镜检测方法中，需要固定、脱干、垫入、分割和染色等步骤，耗时相对较长，且 微生物品种繁多，容易产生误诊，对操作人员要求较高。在血清学检测方法中，检测的基础 是抗原抗体的特异反应。如检测抗原，除了要求抗体，抗体为单抗或多抗，是特异的外，还要 求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇，如果因为基因突变导致某些位 点的不表达，或者结合位点因为某些原因被封闭或阻断，都会影响抗体与抗原的结合，造成 假阴性结果；如检测抗体，则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时 又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往由于技术水平的限制而难以完全做到。因此，从 某种意义上来说，血清学实验的假阳性和假阴性是不能完全避免的，从而影响了实验的准 确性。PCR是目前在病原检测中最常用的方法。目前，已有普通PCR、巢式PCR和荧光定量 PCR等多种PCR方法应用于牛白血病的检测。然而，普通PCR需要结合琼脂糖凝胶电泳试验 进行结果的判定，因而操作较为繁琐且耗时较长，从而达不到快速检测的效果。 至今，中国国内很少有用实时荧光定量PCR方法检测牛白血病。实时荧光定量 PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后 通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术实现了 PCR从定性到定量的飞跃， 它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点成为了分子生物学研究中 的重要工具，目前已得到广泛应用。由于实时荧光定量PCR是实时定量检测致病病原体基 因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到的优势。 目前，缺乏一种检测灵敏度高的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒及其检测 方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供了 一种检测灵敏度高的检测牛白血病的荧光 定量PCR的试剂盒及其检测方法。 为了实现上述目的，本专利技术通过如下技术方案实现：一种检测牛白血病的荧光定 量PCR的FRET-PCR引物、探针和标准阳性模板，所述FRET-PCR引物为上游引物和下游引 物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针； 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQ ID No. 2的核苷酸序列； 所述6-FAM探针具有SEQ ID No. 3的核苷酸序列； 所述LCRed640探针具有SEQ ID No. 4的核苷酸序列； 所述标准阳性模板具有SEQ ID No. 5的核苷酸序列。 本专利技术的一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，所述试剂盒包括： FRET-PCR引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、标准阳性模 板、对照品；所述对照品为超纯水。 进一步地，所述标准阳性模板是由所述的FRET-PCR的引物和探针对牛白血病前 病毒DNA进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。 进一步地，所述FRET-PCR引物的终始浓度为0. 2 μ M ;所述6-FAM探针的终始浓度 为0. 2 μ M ;所述LCRed640探针的终始浓度为0. 2 μ Μ。 更进一步地，所述热启动Taq酶的终始浓度为2. 0U/20 μ L ;所述dNTP的终始浓度 为5 μ M ;所述标准阳性模板的终始浓度为5ng ;所述对照品的终始浓度为5ng。 本专利技术的一种牛白血病的荧光定量PCR的扩增检测体系，所述扩增检测体系包括 20 μ 1的PCR扩增检测体系：DNA模板或者定量标准试剂10 μ I、IxPCR缓冲液、1 μ M上游引 物、ΙμΜ下游引物、0. 2μΜ的6-FAM探针、0. 2μΜ的LCRed640探针、2个单位的Taq酶和 200 μ M dNTP〇 本专利技术所述的试剂盒进行牛白血病的荧光定量PCR的检测方法，在孔板中加入试 齐IJ，加样完毕后，将孔板放入系统中，设置反应条件为：预变性、18个温度递减的高严谨循 环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环； 预变性：l*2min@95°C ;18 个温度递减的高严谨循环：6*lsec@95°C，12sec@70°C， 8seci72〇C ；9*lseci95〇C, 12seci68〇C, 8seci72〇C ；3*lseci95〇C, 12seci66〇C , 8seci72〇C ； 30个欠严谨的荧光获得循环：30*lsec@95 °C，30sec@56 °C (在此收集荧 光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 个熔解循环：l*lsec@95°C，10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，包括FRET‑PCR引物、探针和标准阳性模板，其特征在于：所述FRET‑PCR引物为上游引物和下游引物；所述探针为6‑FAM探针和LCRed640探针；所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述6‑FAM探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述LCRed640探针具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；所述标准阳性模板具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1. 一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，包括FRET-PCR引物、探针和标准阳性 模板，其特征在于：所述FRET-PCR引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和 LCRed640 探针； 所述上游引物具有SEQIDNo. 1的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQIDNo. 2的核苷酸序列； 所述6-FAM探针具有SEQIDNo. 3的核苷酸序列； 所述LCRed640探针具有SEQIDNo. 4的核苷酸序列； 所述标准阳性模板具有SEQIDNo. 5的核苷酸序列。2. -种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括： FRET-PCR引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、标准阳性模 板、对照品；所述对照品为超纯水。3. 根据权利要求2所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于：所述 标准阳性模板是由所述的FRET-PCR的引物和探针对牛白血病前病毒DNA进行扩增获得的 扩增核苷酸片段插入PUC57载体构建而成的重组质粒。4. 根据权利要求2所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于：所述 FRET-PCR引物的终始浓度为0. 2μM;所述6-FAM探针的终始浓度为0. 2μM;所述LCRed640 探针的终始浓度为0.2μΜ。5. 根据权利要求4所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于：所述 热启动Taq酶的终始浓度为2. 0U/20μL;所述dNTP的终始浓度为5μM;所述标准阳性模板 的终始浓度为5ng;所述对照品的终始浓度为5ng。6. -种牛白血病的荧光定量PCR的扩增检测体系，其特征在于：所述扩增检测体系包 括20μ1的PCR扩增检测体系：DNA模板或者定量标准...
【专利技术属性】
技术研发人员：王成明，杨奕，陆光武，杨章平，毛永江，郭伟娜，危蓝菁，张继垒，李静，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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