【技术实现步骤摘要】
本申请涉及鲢(hypophthalmichthys molitrix)，具体涉及一种3个grna联用的高效鲢bmp6基因敲除方法及应用。
技术介绍
1、鲢(hypophthalmichthys molitrix)是我国重要的淡水养殖鱼类，为我国特有的“四大家鱼”之一。2022年养殖产量达387.98万吨，长期以来位居淡水养殖产量第二位，为保障水产品稳定有效供给做出了重要贡献。鲢属典型的节粮型养殖鱼类，主要以浮游植物为食，生产上无需投饵，节约了资源；鲢还可控制水体富营养化，调节水质，生态意义重大。此外，鲢价格低廉，以较低的价格就能获得高品质蛋白，为提高广大人民的生活品质发挥了重要作用。
2、基因编辑技术是一种通过对特定dna片段的插入、敲除、修饰或替换等，能够精确改造生物基因组，实现基因定点敲除和外源基因定点整合，对生物体中目标基因进行编辑的技术(魏景亮,吴添文,阮进学,et al.基因组编辑技术改良家畜的研究进展[j].中国农业科技导报,2014(1):7.doi:10.13304/j.nykjdb.2014.003.)。近年来出现的锌指核酸酶(zinc finger nuclease，zfn)、转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，talen)和成簇规律间隔短回文重复序列-相关蛋白系统9(clustered regularly interspersed shortpalindromic repeats-crisprassociate
3、目前基因编辑技术已广泛用在经济鱼类性状改良和基因功能研究方面(suny,zheng g d,nissa m,etal.disruption ofmstna andmstnb gene through crispr/cas9leads to elevated muscle mass inblunt snoutbream(megalobrama amblycephala)[j].aquaculture,2020,528:735597.doi:10.1016/j.aquaculture.2020.735597)。
4、利用crispr/cas9系统成功建立了多种socs1的突变品系，与同期野生型(wt)相比，socs1a突变杂合体(socs1a+/-)和socs1b突变杂合体(socs1b+/-)团头鲂的生长性能增强，体质量显著增加。然而，在鲢的基因功能和遗传改良育种等方面的研究却进展缓慢，一直受制于有效基因编辑方法的缺乏，传统的单一靶位点突变，打靶效率较低，容易造成无义突变。
技术实现思路
1、本申请针对传统的单一靶点敲除，打靶效率较低，dna自主修复不确定性高容易造成无义突变的缺陷，提供了一种在鲢三个grna位点敲除bmp6基因的方法及应用；本申请选取鲢bmp6基因(该基因全长54028bp，包含7个外显子和6个内含子)，在该基因结构域的第一个外显子上设计合成三个靶位点，然后，通过体外转录合成三个靶基因的grna，然后与cas9蛋白混合，采用显微注射的方式将混合物导入鲢受精卵单细胞期的动物极中，孵化后即可获得靶基因突变的鲢f0代。本申请高效地实现了鲢基因敲除，为开展鲢的育种和基因功能研究提供了有效的技术手段。
2、第一方面，实施例公开了靶向鲢(hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的grna，其核苷酸序列如seq id no.1～3中至少一项所示。其中，bmp6基因seq id no.8所示。
3、在第一方面的实施例中，所述grna所述bmp6基因第一外显子。
4、第二方面，实施例公开了鲢(hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的敲除组合物，其包括第一方面所述的grna和cas9蛋白。
5、第三方面，实施例公开了鲢(hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的敲除试剂盒，其包括第一方面所述的grna和cas9蛋白。
6、第四方面，实施例公开了鲢(hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的敲除方法，其包括将如seq id no.1所述的第一grna、如seq id no.2所述的第二grna、如seq idno.3所述的第三grna以及cas9蛋白注释至所述鲢单细胞期的受精卵中。
7、在第四方面的实施例中，所述第一grna、所述第二grna和所述第三grna的注释质量比为1:1:1。
8、在第四方面的实施例中，从所述鲢的后代中筛选突变体。
9、第五方面，实施例公开了第一方面所述grna的制备方法。该制备方法包括：设计并合成grna的引物对；将所述引物对进行pcr扩增；从所述pcr扩增的产物中回收所述grna。
10、在第五方面的实施例中，用于得到如seq id no.1所述的第一grna的引物对包括如seq id no.4所述的上游引物和如seq id no.7所示的下游引物；用于得到如seq idno.2所述的第二grna的引物对包括如seq id no.5所述的上游引物和如seq id no.7所示的下游引物；用于得到如seq id no.3所述的第三grna的引物对包括如seq id no.6所述的上游引物和如seq id no.7所示的下游引物。
11、第六方面，实施例公开了第一方面所述的grna在培育鲢突变品系中的应用。
12、实施例提供的grna、基因敲除组合物、试剂盒、方法及应用，针对鲢bmp6基因第一外显子设计了三个grna靶位点，敲除效率明显提高，f0代敲除效率高达86.11％。
13、实施例提供的筛选方法可用于获得鲢基因突变品系。该方法简单易行，操作简单。利用基因突变的方法获得鲢基因突变品系，对开展水产生物基因功能研究，揭示其遗传发育规律，发掘和利用遗传资源培育高产、耐低氧品种等具有重要的科学意义。
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1.靶向鲢(Hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1～3中至少一项所示。
2.根据权利要求1所述的gRNA，其靶向所述bmp6基因的第一外显子。
3.鲢(Hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的敲除组合物，其包括如权利要求1或2所述的gRNA和Cas9蛋白。
4.鲢(Hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的敲除试剂盒，其包括如权利要求1或2所述的gRNA和Cas9蛋白。
5.鲢(Hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的敲除方法，其包括将如SEQ ID NO.1所述的第一gRNA、如SEQ ID NO.2所述的第二gRNA、如SEQ ID NO.3所述的第三gRNA以及Cas9蛋白注释至所述鲢单细胞期的受精卵中。
6.根据权利要求5所述的敲除方法，所述第一gRNA、所述第二gRNA和所述第三gRNA的注释质量比为1:1:1。
7.根据权利要求5或6所
8.如权利要求1或2所述的gRNA的制备方法，其包括：
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，
10.权利要求1或2所述的gRNA在培育鲢突变品系中的应用。
...【技术特征摘要】
1.靶向鲢(hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的grna，其核苷酸序列如seq idno.1～3中至少一项所示。
2.根据权利要求1所述的grna，其靶向所述bmp6基因的第一外显子。
3.鲢(hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的敲除组合物，其包括如权利要求1或2所述的grna和cas9蛋白。
4.鲢(hypophthalmichthys molitrix)bmp6基因的敲除试剂盒，其包括如权利要求1或2所述的grna和cas9蛋白。
5.鲢(hypophthalmichthys molitri...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁宏伟，李晓晖，冯翠，张泽文，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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