【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，特别是涉及一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、聚苹果酸(poly malic acid，pmla)又名聚羟基丁二酸酯是一种生物高分子材料，是以唯一的单体l-苹果酸(l-malic acid，l-ma)通过无数酯键聚合后形成的脂肪族聚合物。聚苹果酸是唯一一种含酯键又能快速水解的高分子聚合物，水解产物为l-苹果酸单体，可进入三羧酸循环中被降解。聚苹果酸侧链存在大量游离的羧基，容易被修饰或改性，与具有功能分子的活性基团相结合，从而使其附有特殊功能。因此在生物医药、食品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。聚苹果酸作为高分子聚酯材料，具有优良的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、易修饰性、非免疫原性和无毒性，在生物医学材料、可降解塑料、吸水材料、抗菌食品包装材料等领域有广泛的应用前景，是最具发展潜力的“绿色塑料”。
2、目前，聚苹果酸的合成方法主要分为化学合成法和生物合成法。化学合成法主要有开环聚合法和直接聚合法，可以得到3种构型的pmla，其中开环聚合法技术较为成熟。但与生物合成法相比，化学法合成的pmla分子量较小，合成步骤长，提纯工艺复杂，生产成本高，严重制约了其规模化发展。微生物合成法是由微生物体内通过三羧酸循环代谢，能得到相对分子量较大的pmla，且具有较高的化学纯度和光学纯度，性能优异，成为当前的研究热点。微生物合成聚苹果酸时，一般会加入碳酸钙等中和剂，合成聚苹果酸钙。聚苹果酸钙除了可以酸化获得聚苹果酸、l-苹果酸单体外，还可以直接作为人和动物的保健
3、目前，很多能够合成pmla的微生物，大多是致病微生物，具有一定的安全风险，难以应用在食品和饲料行业；或者是难于扩大培养的微生物，鲜有产业化成功的案例。利用易于扩大培养的食品安全级别的微生物高效合成pmla，是解决上述问题的新研究方向。
4、里氏木霉是重要的工业生产菌株，符合gras(generally regarded as safe)标准，其发酵产物已被广泛应用于食品、饲料等行业。目前还未出现利用里氏木霉菌株发酵生产聚苹果酸的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术通过提高聚苹果酸合成酶基因的表达强度，构建出高效生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌，利用该里氏木霉工程菌发酵生产聚苹果酸，产量可达90g/l。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种聚苹果酸合酶蛋白，氨基酸序列如seq id no.6所示。
4、本专利技术还提供一种上述的聚苹果酸合酶蛋白的编码基因，核苷酸序列如seq idno.5所示。
5、本专利技术还提供一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌的构建方法，包括将重组载体转化入里氏木霉宿主菌中，通过基因重组构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；
6、所述里氏木霉工程菌通过过表达聚苹果酸合酶蛋白来生产聚苹果酸；
7、所述聚苹果酸合酶蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示；
8、所述重组载体的骨架载体为lml2.0a，包括pma基因n端片段；
9、所述pma基因n端片段的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10、进一步地，所述聚苹果酸合酶蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
11、进一步地，所述重组载体含有依次连接的pma基因上游序列、启动子和所述pma基因n端片段。
12、进一步地，所述pma基因上游序列如seq id no.1所示；所述启动子的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.7所示。
13、进一步地，所述里氏木霉宿主菌为qm6a、qm9414、rut-c30、rl-p37、ng14或pc-3-7。
14、本专利技术还提供一种根据上述的构建方法构建得到的里氏木霉工程菌。
15、本专利技术还提供上述的里氏木霉工程菌在生产聚苹果酸或l-苹果酸中的应用。
16、本专利技术还提供一种生产聚苹果酸的方法，包括利用上述的里氏木霉工程菌发酵生产得到聚苹果酸的步骤。
17、本专利技术还提供一种生产l-苹果酸的方法，包括利用上述的里氏木霉工程菌发酵生产得到聚苹果酸，再将所述聚苹果酸水解，得到所述l-苹果酸的步骤。
18、本专利技术公开了以下技术效果：
19、本专利技术以里氏木霉菌为出发菌株，不引入任何外源基因，通过过表达内源的聚苹果酸合成酶基因，使原先不具备聚苹果酸生产能力的里氏木霉，改造为可以高效生产聚苹果酸的基因工程优化菌株，构建成符合食品安全的聚苹果酸生产菌株，避免产生生物安全性和转基因安全性等问题。
20、本专利技术获得基因工程优化菌株不携带转基因成分，不含有任何外源基因序列，不含有抗性筛选标记，能以葡萄糖、乳糖等常见碳源为基础，直接发酵生产大量的聚苹果酸，其最高产量可达90g/l。本专利技术提供的聚苹果酸可以快速水解成l-苹果酸。优化菌株来源于食品安全菌株，属于非转基因物种，其生产的聚苹果酸属于非转基因食品。本专利技术提供了利用食品安全微生物发酵聚苹果酸的新方法，可应用于聚苹果酸和l-苹果酸的工业化生产。
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1.一种聚苹果酸合酶蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种如权利要求1所述聚苹果酸合酶蛋白的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括将重组载体转化入里氏木霉宿主菌中，通过基因重组构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述聚苹果酸合酶蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体含有依次连接的pma基因上游序列、启动子和所述pma基因N端片段。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述pma基因上游序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.7所示。
7.一种根据权利要求3-6任一项所述的构建方法构建得到的里氏木霉工程菌。
8.一种如权利要求7所述的里氏木霉工程菌在生产聚苹果酸或L-苹果酸中的应用。>
9.一种生产聚苹果酸的方法，其特征在于，包括利用权利要求7所述的里氏木霉工程菌发酵生产得到聚苹果酸的步骤。
10.一种生产L-苹果酸的方法，其特征在于，包括利用权利要求7所述的里氏木霉工程菌发酵生产得到聚苹果酸，再将所述聚苹果酸水解，得到所述L-苹果酸的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种聚苹果酸合酶蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.6所示。
2.一种如权利要求1所述聚苹果酸合酶蛋白的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.5所示。
3.一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括将重组载体转化入里氏木霉宿主菌中，通过基因重组构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述聚苹果酸合酶蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体含有依次连接的pma基因上游序列、启动子和所述pma基因n端片段。
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