【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测沙门氏菌的一步法crispr/cas12b检测试剂盒及方法。
技术介绍
1、沙门氏菌(salmonella,sal)是全世界重要的食源性病原体之一，可引起严重的公共卫生问题。全球每年有超过1.53亿例肠胃炎病例和57000人死于sal。迄今为止，已鉴定出2600多种sal血清型。其中，鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌是引起人类肠胃炎的两种主要血清型。通常，食用受污染的食物是sal介导的感染的主要来源。在中国，sal在细菌性食物中毒中排名第一，约占70％-80％。因此，一种准确、快速的sal检测方法对于阻断食源性疾病的爆发和维护公众健康至关重要。
2、基于细菌培养的方法已用于sal检测很长时间，该检测方法基于实验室、耗时并且劳动密集。迄今为止，基于聚合酶链式反应(pcr)的方法也已广泛用于sal检测，目前被认为是诊断金标准。然而，由于所需仪器复杂、要求技术人员经验丰富并且反应周期长等因素的限制，该方法难以在资源有限的地区实施。等温扩增克服了基于pcr的方法的缺点，并在恒定温度下进行，而不需要特定的设备，如lamp(环介导的等温扩增)和重组酶聚合酶扩增(rpa)。此外，相关的基于lamp或rpa的平台在检测sal方面表现出高灵敏度和特异性。然而，等温扩增试验的假阳性结果相对较高。为了解决这一问题，将等温扩增技术引入crispr/cas系统(成簇的规则间隔的短回文重复序列和crispr相关蛋白)，以提高准确性。一些基于crispr的分子诊断系统已经成功创建用于sal检测，如la
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术拟建立一种单管rpa-crispr/cas的沙门氏菌快速检测体系，忽略了冗余的开帽过程，以避免实际不便和交叉污染。
2、本专利技术的目的是提出一种基于crispr的沙门氏菌检测体系及试剂盒。为了实现本专利技术的上述目的，拟采用如下技术方案：
3、本专利技术一方面涉及一种基于crispr的沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括f引物、r引物、向导rna、cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述f引物的核苷酸序列如seq idno.2所示；所述r引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述向导rna的核苷酸序列如seqid no.16所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-fam/tttttttt/bhq1/-3’。
4、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括聚合酶和dntp。
5、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括：缓冲液。
6、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒中，每50μl包括：
7、
8、本专利技术另一方面还涉及一种基于crispr检测沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：
9、采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。
10、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述检测的温度为30℃～50℃，优选37℃～42℃，更优选40℃～42℃。
11、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述检测方法中的核酸扩增和检测可同步进行，中间不需要开盖。
12、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述沙门氏菌包括选自下组的一种或两种以上沙门氏菌：鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌、波斯坦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、双亚利桑那沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、邦戈尔沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。
13、本专利技术将重组酶聚合酶扩增(rpa)技术与基于crispr/cas12b的系统在一锅平台上开发了一种新的沙门氏菌诊断系统(rpa-crispr/cas12b)，即一管法或一锅法或一步法，核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。实验结果表明，本专利技术的沙门氏菌感染检测系统是简单和准确的。
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1.一种基于CRISPR的沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括F引物、R引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒中，每50μL包括：
5.一种基于CRISPR检测沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，所述检测的温度为30℃～50℃，优选37℃～42℃，更优选40℃～42℃。
7.根据权利要求5所述的方法，所述检测方法中的核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。
8.根据权利要求5所述的方法，所述沙门氏菌包括选自下组的一种或两种以上沙门氏菌：鸡白痢沙门
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr的沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括f引物、r引物、向导rna、cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述f引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述r引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述向导rna的核苷酸序列如seq id no.16所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-fam/tttttttt/bhq1/-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括聚合酶和dntp。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒中，每50μl包括：
5.一种基...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚建森，张笛，盛中伟，许明，董永毅，张萍，李婷婷，窦新红，吴坤，陈莉，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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