五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了五种猪肠道病毒多重RT‑PCR快速检测引物组，包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。据此，发明专利技术人还研制了对应的快速检测试剂盒。应用本发明专利技术可在同一反应管内同时检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒的单个或混合感染，具有特异性高，敏感性好，耗时短且成本低的特点。本发明专利技术为猪群混合感染的检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有利于养猪业及时制定治疗方案，减少猪群死亡率和经济损失。

Five * multiplex RT-PCR rapid detection kit for swine enterovirus and its application

The present invention discloses five primers for rapid detection of porcine enteroviruses by multiplex RT_PCR, including five pairs of PCR primers. They are directed against five kinds of porcine enteroviruses, namely PEDV, TGEV, PDCoV, PRoV and PKV, and each of them has a base sequence of SEQ.ID.NO.1 to SEQ.ID.NO.10. Accordingly, the inventor also developed the corresponding rapid detection kit. The invention can simultaneously detect single or mixed infection of five kinds of porcine enteroviruses PEDV, TGEV, PDCoV, PRoV and PKV in the same reaction tube, and has the characteristics of high specificity, good sensitivity, short time-consuming and low cost. The invention provides a rapid and simple tool for detection of mixed infection in pigs, lays a solid foundation for rapid clinical differential detection and laboratory epidemiological investigation, is beneficial to formulating treatment schemes in time in pig industry, and reduces the mortality and economic losses of pigs.

【技术实现步骤摘要】
五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒及其应用
本专利技术属于猪肠道病毒核酸检测
，尤其涉及五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒及其应用。
技术介绍
近年来，随着养猪业向集约化、规模化方向发展，猪群发生多种病原混合感染的情况愈加普遍。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)是哺乳仔猪病毒性肠道疾病的主要病原体，由于其病理变化在临床症状及流行病学上的相似性，难以区分这些疾病。同时，根据专利技术人对猪嵴病毒(PKV)的监测发现，其在PEDV阳性猪中检测率极高，并推测其不止与猪肠道疾病有关，还可能与PEDV发生协同致病作用。上述疾病在猪群的混合感染不仅会给实验室诊断和临床治疗带来巨大的挑战，也将给养猪业造成重大的经济损失。猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种猪的急性肠道传染病，临床主要表现为水样腹泻和严重脱水，对哺乳期仔猪的发病率高达80～100％，是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。该病在1976年首次报道于英国，2010年在中国、泰国等亚洲国家爆发了疫情，2013年在美国出现大规模的流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪传染性胃肠炎(Porcinetransmissiblegastroenteritis，TGE)是猪传染性胃肠炎病毒(Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)导致猪的一种急性、高度接触性胃肠道传染病。TGEV与PEDV同属冠状病毒科、冠状病毒属成员，其导致的主要临床症状与PEDV极为相似，并且都以仔猪的高发病率和死亡率为特征。因其在世界范围造成的危害严重，世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类疾病中必检的猪传染病。猪Delta冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus，PDCoV)是一种能够引起仔猪急性水样腹泻的新发冠状病毒。2012年在中国香港首次从猪粪便样品中检测并分离出PDCoV。2014年2月，俄亥俄州和印第安纳州首次发现了PDCoV，迅速传播到美国和加拿大的其他州，并在猪业中造成重大经济损失。2015年3月，中国江西省发现PEDV阴性的腹泻样本中PDCoV发病率高达58.33％。临床报道表明，PDCoV可引起仔猪严重腹泻，呕吐和脱水，与PEDV、TGEV所致的症状无明显区别。轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤病毒科轮状病毒属的成员，是人和各种幼龄脊椎动物病毒性腹泻的常见病原。猪轮状病毒(Porcinerotavirus，PRoV)对幼龄仔猪最易感，1～4周龄仔猪发病率超过80％，死亡率达7％～20％，与PEDV、TGEV所致的临床症状无明显区别，主要表现为严重腹泻、呕吐、脱水、消瘦、生长缓慢等。猪嵴病毒(Porcinekobuvirus，PKV)属于小RNA病毒科，引起的症状以腹泻为特征。研究学者针对来自中国24省236份病料进行PKV检测发现阳性率为42.85％，病毒分布几乎覆盖整个中国大陆。有证据表明PKV在腹泻病例的检出率较高，推断其对猪胃肠炎有协同致病作用。而根据专利技术人对猪嵴病毒(PKV)的监测发现，其在PEDV阳性猪中检测率极高，故推测其不止与猪肠道疾病有关，还可能与PEDV发生协同致病作用。上述PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种病毒均为单股正链RNA病毒，基因组含PolyA结构，均能造成仔猪不同程度的肠道腹泻、脱水、呕吐、消瘦等症状。PEDV、TGEV、PDCoV均为冠状病毒，与PRoV是哺乳仔猪病毒性肠道疾病的主要病原体，其暴发给当前养猪业带来巨大的经济损失。研究表明，这些肠道病毒往往呈现混合感染的趋势，若未能明确其病因则难以对症下药，采取正确的免疫措施。研究表明多种病毒混合感染引起猪的腹泻疫病，严重危害猪的生产工作，而且根据临床症状和流行病学较难区分，必须依靠实验室检测技术进行鉴别诊断。其中电镜观察、病毒分离、免疫组织化学和荧光抗体技术等常用诊断技术操作复杂，难度较大；ELISA病原快速检测试剂盒和常规RT-PCR方法的应用比较广泛，但血清学方法准确率较低，常用的单一PCR方法耗时长。因此，有必要建立能同时检测多种病毒的快速的早期诊断方法，以便尽快采取有效的防控措施，减少这些疾病对养猪业造成的危害。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供快速简便、准确特异的五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒及其应用，该试剂盒可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV和PKV等五种猪肠道病毒，适用于临床及科研中对五种猪肠道病毒的快速检测及流行病学调查。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测引物组，包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。五对PCR引物分别为：PEDV-F：TGTTATACTTTGGCTTTTCGT，PEDV-R：CATAGAAAGCCCAACCAGT；TGEV-F：GACGGCGACCAGATAGAAGT，TGEV-R：CGTATAGGATTGCTTGTACC；PDCoV-F：TTGGCGACTGGCTGCGTTAC，PDCoV-R：GCAATACCTCGGCTGATT；PRoV-F：AAGGATGCTAGGGATAAAATTG，PRoV-R：TTCAGATTGTCGAGCTATTCCA；PKV-F：GCTGCTTGGTGGACTCATT，PKV-R：GAGGGTGGCATCAAAACACT。上述引物组在制备五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒中的应用。五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品和引物组成，引物包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。PCR标准品包括PEDV标准品、TGEV标准品、PDCoV标准品、PRoV标准品和PKV标准品；阳性对照品是含PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种病毒的阳性质粒混合物；阴性对照品是灭菌后的去离子水。质粒混合物的浓度为7.56×109copies/μL。五对PCR引物中的所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。上述试剂盒用于五种猪肠道病毒的非诊断目的特异性检测。针对五种猪肠道病毒存在交叉感染、混合感染且难以区分的问题，专利技术人运用多重RT-PCR技术，针对性地设计了相应的特异性引物，共同构成了五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测引物组，包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列；五对PCR引物。据此，专利技术人还研制了对应的快速检测试剂盒。应用本专利技术可在同一反应管内同时检测PE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.五种猪肠道病毒多重RT‑PCR快速检测引物组，其特征在于包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测引物组，其特征在于包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。2.根据权利要求1所述的五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测引物组，其特征在于所述五对PCR引物分别为：PEDV-F：TGTTATACTTTGGCTTTTCGT，PEDV-R：CATAGAAAGCCCAACCAGT；TGEV-F：GACGGCGACCAGATAGAAGT，TGEV-R：CGTATAGGATTGCTTGTACC；PDCoV-F：TTGGCGACTGGCTGCGTTAC，PDCoV-R：GCAATACCTCGGCTGATT；PRoV-F：AAGGATGCTAGGGATAAAATTG，PRoV-R：TTCAGATTGTCGAGCTATTCCA；PKV-F：GCTGCTTGGTGGACTCATT，PKV-R：GAGGGTGGCATCAAAACACT。3.权利要求1所述引物组在制备五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳康，钟莲，黄伟坚，王若木，陆颖，吴雨殊，刘雪婷，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45